本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種利用小型玻璃生物反應(yīng)器(3～10L)培養(yǎng)人參不定根的方法。首先將長度約1.0cm的人參不定根培養(yǎng)在裝有2.0L?1/2SH培養(yǎng)基的3L反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含3.0mg/L?IBA和20g/L蔗糖。定期分析人參不定根的生長和三種人參皂苷(Rg1、Re、Rb1)的累積，確定了人參不定根在生物反應(yīng)器內(nèi)的最佳收獲周期為7周。3L生物反應(yīng)器培養(yǎng)基中三種蔗糖濃度(20g/L、40g/L、60g/L)中，20g/L、40g/L兩個濃度的蔗糖對人參不定根的人參不定根的生長和皂苷的累積優(yōu)于60g/L蔗糖，兩者無顯著差別，但從節(jié)約角度考慮，應(yīng)該選擇20g/L蔗糖濃度用于生產(chǎn)。該濃度下，人參皂苷含量和產(chǎn)量分別為5.16mg/g、30.71mg。5和10L生物反應(yīng)器內(nèi)在初始接種量分別為：10、15、20g和20、25、30g中，最佳量分別為15和30g，其不定根的生長量分別為9.29和19.17g，皂苷含量分別為5.16和4.58mg/g。生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)7周的人參與栽培4年的人參相比，人參皂苷Rg1和Re含量相差不大；栽培人參中Rb1的含量遠高于生物反應(yīng)器中培養(yǎng)得人參不定根中的含量。本發(fā)明專利技術(shù)可為人參不定根的小規(guī)模和進一步擴大化培養(yǎng)提供技術(shù)支持和參數(shù)，也可以作為大規(guī)模生產(chǎn)提供人參不定根種子生產(chǎn)方法。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)專利涉及利用一種小型簡易生物反應(yīng)器，人工室內(nèi)培養(yǎng)人參不定根，并從中提取人參皂苷的技術(shù)，屬農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)介紹
人參(Panax ginseng C. A. May.)為五加科(Araliaccae)人參屬名貴中藥植物，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，被譽為藥中之王。人參化學(xué)成分復(fù)雜，其中主要藥用成分為各種人參皂苷，其制品及皂苷提取物具有廣闊的世界市場。但人參5 6年栽培的漫長周期使各項管理技術(shù)、土地、病蟲、農(nóng)殘等問題成為栽培人參難以跨越的障礙。因此，利用生物反應(yīng)器規(guī)模化培養(yǎng)細胞成為解決上述問題的有效方法之一。生物反應(yīng)器具有工作體積大、單位 體積生產(chǎn)能力高、物理和化學(xué)條件控制方便、隨時隨地規(guī)模化生產(chǎn)等許多優(yōu)點。目前，人參細胞生物反應(yīng)器規(guī)模化培養(yǎng)已獲得成功。但有研究認為，人參不定根和毛狀根中的人參阜苷含量比愈傷組織(細胞)中多。因此，人參不定根生物反應(yīng)器培養(yǎng)更引人注目。韓國該方面的研究處于世界領(lǐng)先地位，Choi等報道了利用500L生物反應(yīng)器規(guī)模化培養(yǎng)人參不定根的中試研究結(jié)果。而我國對人參不定根生物反應(yīng)器擴大培養(yǎng)的技術(shù)研究卻相對較少。例如，樸炫春等報道了利用5L氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根的生長周期，但未測定其皂苷的累積。黃滔等優(yōu)化了搖瓶培養(yǎng)人參不定根系統(tǒng)，還未進行生物反應(yīng)器培養(yǎng) 0本專利技術(shù)通過一種簡單的小型玻璃生物反應(yīng)器(3 10L)，確定小規(guī)模培養(yǎng)人參不定根和生產(chǎn)人參阜苷的方法；目的是提供一種更加簡單、室內(nèi)大量人工培養(yǎng)人參不定根的方法，為大規(guī)模培養(yǎng)人參不定根生產(chǎn)人參皂苷，提供技術(shù)參數(shù)，或為大規(guī)模生產(chǎn)提供人參不定根種子培養(yǎng)方法；或為進行小規(guī)模培養(yǎng)人參不定根生產(chǎn)人參皂苷提供技術(shù)支持。
技術(shù)實現(xiàn)思路
首先將人參不定根在含有3. 0mg/L IBA的1/2SH固體培養(yǎng)基中大量繁殖。然后將人參不定根切成Icm長，接種在裝有I. 5L 1/2SH (加有3. 0mg/L IBA和20g/L蔗糖)培養(yǎng)基、總體積為3L的生物反應(yīng)器內(nèi)進行暗培養(yǎng)。定期取材測定不定根鮮重和干重、生長量及3種人參皂苷含量(Rgl+Re+Rbl)，繪制不定根生長和皂苷累積的動態(tài)曲線，確定其生長周期以及最佳收獲時間為7周。然后，在總體積為3L的生物反應(yīng)器中加入含有20g/L蔗糖的1.5L 1/2SH培養(yǎng)基(加有3. 0mg/L IBA)，接種8g人參不定根段。培養(yǎng)7周后收獲，其不定根人參皂苷含量(Rgl+Re+Rbl)及產(chǎn)量最高，分別為5. 16mg/g，30. 7Imgo按照上面的蔗糖濃度，在總體積為5和10L的生物反應(yīng)器中，初始接種人參不定根的鮮重分別為15和30g時，培養(yǎng)7周后它們壓、15分鐘))后使用的。培養(yǎng)環(huán)境為常規(guī)組織培養(yǎng)室(溫度24 26°C，光照強度1000 1500Lx，光/暗周期16h/8h，濕度60% 70% )的。本專利技術(shù)的優(yōu)越特征I、小型生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)簡單，便于操作2、利用小型生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定可以在人為控制條件下，隨時隨地生產(chǎn)人參不定根3、小型生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根無任何細菌病毒、重金屬污染，安全4、小型生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人參不定根中的人參皂苷Rgl和Re含量與大田栽培的人參含量相差不大 附圖說明圖I生物反應(yīng)器示意圖a.薄膜空氣濾器；b.玻璃罐體；c.空氣噴頭；d.空氣流量計；e.空氣壓力泵；f.進氣口 ；g.出氣口。圖2標準品(A)、生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根(B)和栽培4年人參根(C)中人參皂苷 Rgl、Re、Rbl 的 HPLC 圖譜圖3人參不定根的生物反應(yīng)器增殖培養(yǎng)A.繼代的人參不定根；B.人參不定根在生物反應(yīng)器培養(yǎng)；C. B中干燥的人參不定根圖4 3L生物反應(yīng)器中不定根生長(A)和皂苷累積⑶的動態(tài)曲線具體實施例方式實例I確定小型生物反應(yīng)器內(nèi)人參不定根收獲周期I)小型玻璃生物反應(yīng)器所用小型生物反應(yīng)器為總體積3、5和IOL的氣升式小型玻璃生物反應(yīng)器自己開發(fā)，北京玻璃儀器公司定制。2)人參不定根材料人參不定根的生物反應(yīng)器培養(yǎng)都在溫度為(25±2)°C培養(yǎng)室中進行暗培養(yǎng)。人參不定根最初從韓國江原道野生山參(Panax ginseng C. A. May.)的須根(由韓國江原大學(xué)山林科學(xué)學(xué)院崔龍義教授鑒定)在1/2SH+3. Omg/L IBA+20g/L蔗糖+3. Og/L脫乙酰吉蘭糖膠(Gelrite)的固體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)而來，然后多次繼代增殖。3)三種人參皂苷(Rgl、Re、Rbl)的分析方法人參皂苷采用超聲提取精密稱取I. Og樣品粉末，IOmL 80%甲醇浸泡過夜，次日以80%甲醇室溫超聲提取3次，每次IOmL提取30min，合并提取液。80°C水浴減壓蒸干溶齊U，以20%乙腈溶解并定容至一定體積，搖勻，以O(shè). 45 μ m微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。人參皂苷的高效液相色譜(HPLC)分析方法流動相為乙腈水按表I進行線性梯度洗脫(v/v);流速1.0mL/min，柱溫25°C，檢測波長203nm，進樣量20yL。利用上述條件分析3種人參皂苷標品(Rgl、Re、Rbl)和樣品。3種人參皂苷的保留時間分別為Rgl 23. 46min, Re 24. 45min, Rbl 37. 25min。它們的回歸曲線和回歸系數(shù)分別為Rgl y = 4273. 8x+31641, R2 = O. 9991 ；Re y = 5602. 4x+47471, R2 = 0. 9994 ；Rbl y =4529. 9x+13221, R2 = O. 9994。表I乙腈/水流動相梯度表(v/v) 時間乙腈水 O 13208013 3020 - 2580 — 75 30 3525 - 4075 — 60 35 4040 - 2060 - 80人參阜苷產(chǎn)量的計算方法人參阜苷產(chǎn)量(mg)=人參阜苷含量(mg/g) X人參不 定根生長量(g)4) 3L生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根將增殖的人參不定根切成Icm長，接種在裝有I. 5L 1/2SH (加有3. Omg/L IBA和20g/L蔗糖)培養(yǎng)基、總體積為3L的生物反應(yīng)器內(nèi)進行暗培養(yǎng)。初始接種量(鮮重)為Sg。重復(fù)3 4個生物反應(yīng)器。每周取材I次，置于(60±1)1的烘箱中干燥4811后稱量干重，計算不定根生長量不定根生長量(g)=最終收獲不定根鮮/干重(g)_初始接種不定根鮮/重(g)及3種人參皂苷含量(Rgl+Re+Rbl)，繪制不定根生長和皂苷累積的動態(tài)曲線，從中確定其生長周期以及最佳收獲時間為7周。實例2確定培養(yǎng)基中合適的蔗糖濃度在總體積為3L的生物反應(yīng)器中加入含有不同濃度蔗糖(20、40和60g/L)的I. 5L1/2SH培養(yǎng)基(加有3. Omg/L IBA)，接種8g人參不定根段。每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)7周后收獲，統(tǒng)計及測定人參不定根的生長及皂苷的累積如表2。蔗糖濃度為40g/L時，人參不定根的生長量達到最大值7. 30g，比蔗糖濃度為60g/L時的生長量略高，而遠高于20g/L蔗糖濃度時不定根最低的生長量5. 95g。人參皂苷含量隨蔗糖濃度的增加而降低，蔗糖濃度最低(20g/L)時，皂苷含量達到最大值5. 16mg/g。20和40g/L濃度蔗糖下，人參皂苷產(chǎn)量沒有顯著差異，但都比60g/L蔗糖濃度下人參皂苷產(chǎn)量高。從節(jié)省的角度考慮培養(yǎng)應(yīng)該選用20g本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種利用小型簡易生物反應(yīng)器(3～10L)培養(yǎng)人參不定根生產(chǎn)人參皂苷的方法，其特征在于：長度約1.0cm、鮮重8g的人參不定根培養(yǎng)在裝有2.0L？1/2SH培養(yǎng)基的3L反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含3.0mg/L？IBA和20g/L蔗糖。人參不定根生長和三種人參皂苷(Rg1、Re、Rb1)累積的最佳收獲期為7周；3L生物反應(yīng)器中，相同培養(yǎng)基中含20g/L、40g/L兩個蔗糖濃度對人參和三種人參皂苷累積較佳；5和10L生物反應(yīng)器內(nèi)最佳初始量分別為15和30g。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李玉花，由香玲，譚嘯，代金玲，吳昊，
申請(專利權(quán))人：東北林業(yè)大學(xué)，李玉花，由香玲，
類型：發(fā)明
國別省市：
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