本發明專利技術屬于免疫生物學和生物醫藥領域，涉及封閉TGF-β受體或IL-10受體的多肽、其藥物組合物及其用途。具體地，本發明專利技術涉及一種多肽或多肽組合，其氨基酸序列如下的（1）－（4）中的任一項或多項所示：（1）SEQ?ID?NO：6所示的氨基酸序列，（2）SEQ?ID?NO：14所示的氨基酸序列，（3）SEQ?ID?NO：25所示的氨基酸序列，和（4）SEQ?ID?NO：37所示的氨基酸序列。本發明專利技術的多肽能夠有效地封閉TGF-β受體或IL-10受體，從而增強了T細胞（特別是抗原特異性T細胞）的腫瘤殺傷活性，具有作為治療或輔助治療前列腺癌藥物的潛力。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于免疫生物學和生物醫藥領域，涉及封閉TGF-β受體或IL-10受體的多肽、其藥物組合物及其用途。
技術介紹
惡性腫瘤是危害人類健康的重要疾病。其中，前列腺癌是歐美國家男性發病率最高的惡性腫瘤，在我國發病率逐年上升。惡性腫瘤的T細胞過繼輸入治療在惡性黑色素瘤取得了腫瘤消退，有效率達 50%_70%的治療效果，目前正開始向其他實體瘤過渡 T細胞過繼輸入治療是通過分離病人自身血液或腫瘤組織來源的T細胞(⑶4或CD8)，體外抗原刺激，擴增，活化后再回輸病人，達到特異性殺傷腫瘤細胞的作用。近年來，隨著對調控性T細胞和腫瘤微環境的認識逐漸加深，在過繼輸入治療同時，通過藥物去除或降低患者自身的血白細胞，并利用細胞因子如IL-2，IL-12等維持輸入的T細胞的存活及活性，使療效進一步提高。前列腺癌的惡性生物學表型差異較大，目前主要有嚴密觀察隨訪，手術切除，放射治療以及雄激素阻斷治療。晚期常轉移至其他器官如骨，肝等，且對激素治療不再敏感，演變為激素非依賴性，使治療非常棘手。Sipuleucel-T(Provenge)是FDA批準的第一個用于前列腺癌免疫治療的個體化藥物，使免疫療法在晚期前列腺的治療中占重要地位,其原理主要是回輸經體外融合抗原(PAP+GM-CSF)刺激的抗原遞呈細胞，達到體內刺激活化T細胞的功能。但是，上述方法存在不足之處，例如1)體內抗原活化T細胞仍存在諸多限制，如抗原遞呈效率，共刺激分子等。2)腫瘤局部的微環境，活化的T細胞到達腫瘤局部卻失能。3)針對TGF-β，IL-10的化學小分子阻滯劑，阻斷多不完全和不特異。4)應用病毒載體的基因轉染，試圖使TGF-β受體變異或基因敲除TGF-β受體，存在病毒致基因變異的風險，尚不能應用于臨床。5)目前消除腫瘤局部微環境TGF-β或IL-10的作用主要使用TGF-β或IL-10的抗體阻斷，但由于人源化抗體的獲取困難及異種抗體的免疫原性，臨床應用受限。此外，在前列腺癌的自身抗原特異性T細胞過繼免疫治療中，過繼免疫輸入的T細胞常常受到腫瘤組織內或全身的免疫抑制性細胞的功能抑制，其中轉化生長因子(TGF-β )和白細胞介素IO(IL-IO)是主要的兩種抑制因子。TGF-β有TGF-β l，TGF-02和TGF-33三種類型，分別作用于相應受體TGF-β Rl，TGF- β R2和TGF-β R3。IL-10有受體IL-10RA和IL-10RB。因此，如何有效地使活化的⑶4或⑶8細胞逃過機體和腫瘤的免疫抑制是亟待解決的關鍵問題。
技術實現思路
本專利技術人經過深入的研究和創造性的勞動，發現了一組多肽，并且驚奇地發現，該多肽能夠有效地封閉TGF- β受體和/或IL-10受體，從而使過繼輸入的T細胞對腫瘤局部的免疫抑制機制不敏感，增強了 T細胞(特別是抗原特異性T細胞)的腫瘤殺傷活性，具有作為治療或輔助治療癌癥特別是前列腺癌藥物的潛力。由此提供了下述專利技術本專利技術的一個方面涉及一種多肽或多肽組合，其氨基酸序列如下面的(I) 一(4)中的任意一項或多項(例如任意2、3、或4項)所示 (I) SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列，(2) SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列，(3) SEQ ID NO 25所示的氨基酸序列，和(4) SEQ ID NO 37所示的氨基酸序列。所述多肽或多肽組合可以通過人工化學合成制得。所述多肽或多肽組合物能夠用于封閉TGF-β受體和/或IL-10受體。在本專利技術的一個實施方案中，從噬菌體隨機肽庫中篩選TGF- β Rl，TGF- β R2，TGF-@R3，IL-10RA和IL-10RB的親和短肽。方法以重組可溶性人TGF-β Rl，TGF-β R2，TGF-β R3，IL-10RA和IL-10RB作為靶標，應用噬菌體隨機十二肽庫進行篩選，經過5輪淘選，提取陽性噬菌體克隆ssDNA，測序并進行序列分析。結果通過篩選噬菌體獲得富集，能與人TGF- β Rl, TGF- β R2，TGF- β R3，IL-10RA和IL-10RB特異性結合的噬菌體克隆，測序得到核酸序列，未發現共有保守序列，進一步獲得其多肽序列。本專利技術的另一方面涉及一種抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO 45 (抗原表位肽)或SEQ ID Ν046 (抗原表位模擬肽)所示。所述抗原表位為具有6個跨膜區的前列腺上皮抗原(six transmembrane epithelial antigen of the prostate 2,STEAP2)的針對HLA-A的抗原表位肽VAITLLSLV (SEQ ID NO :45)和抗原表位模擬肽VAMLLSLV (SEQ IDNO :46)。在本專利技術的一個實施方案中，利用噬菌體隨機9肽庫探索STEAP2的抗原表位。以抗STEAP2單克隆抗體(mAb)作為篩選分子，生物淘洗噬菌體遞呈的隨機9肽庫。陽性克隆經夾心ELISA、競爭ELISA鑒定后，隨機挑取10個克隆，DNA測序，同源性分析。結果顯示篩選到的噬菌體展示短肽能特異地與STEAP2結合，這種結合可被天然抗原所抑制。10個克隆的氨基酸序列相同，均為VAITLLSLV (SEQ ID NO :45)。進一步通過逐個突變分析，證實表位模擬肽VAMLLSLV (SEQ ID NO :46)具有較強的T細胞刺激作用。本專利技術的再一方面涉及一種多核苷酸，其編碼本專利技術任一項所述的多肽或者本專利技術任一項所述的抗原表位。本專利技術的再一方面涉及一種核酸構建體，其包含本專利技術任一項所述的多核苷酸；具體地，所述核酸構建體為重組載體；具體地，所述重組載體為重組表達載體。本專利技術的再一方面涉及一種重組細胞，其包含本專利技術任一項所述的核酸構建體。本專利技術的多肽或抗原表位可以通過人工化學合成的方法制得，也可以通過基因重組的方法通過構建合適的表重組達載體，通過適當的宿主細胞(例如大腸桿菌或者酵母等)進行表達。化學合成多肽的技術是本領域成熟的技術，也可以委托商業公司進行合成。用于連接上述各元件來構建本專利技術所述重組表達載體的操作是本領域技術人員所熟知的(參見例如SambiOOk等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)。可以用本領域已知方法回收所產生的多肽。例如，可以通過常規操作(包括，但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發或沉淀)從培養基中回收多肽。·可以通過各種本領域已知的操作來純化本專利技術所述多肽，這些操作包括，但不限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、層析聚焦、和大小排阻層析)、電泳(例如，制備性等電點聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(參見例如，蛋白質純化，J. C. Janson 和 Lars Ryden 編，VCH Publishers, New York, 1989)。本專利技術的再一方面涉及一種在體內或體外活化T細胞的方法，包括使用有效量的一種或兩種本專利技術任一項所述的抗原表位的步驟(例如，在體內或體外，使有效量的一種或兩種本專利技術任一項所述的抗原表位與T細胞相接觸)；具體地，包括下述步驟I)分離提取腫瘤患者自身血液單個核細胞PBMC，重懸于無血清培養基，得到細胞濃度為106/ml — lOVml (例如107/ml)的細胞培本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多肽或多肽組合，其氨基酸序列如下面的（1）－（4）中的任意一項或多項所示：（1）SEQ？ID？NO：6所示的氨基酸序列，（2）SEQ？ID？NO：14所示的氨基酸序列，（3）SEQ？ID？NO：25所示的氨基酸序列，和（4）SEQ？ID？NO：37所示的氨基酸序列。
【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：郭應祿，劉武江，金杰，
申請(專利權)人：北京大學第一醫院，
類型：發明
國別省市：
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