本發明專利技術涉及一種誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法及其在骨關節炎中的應用，具體提供了向軟骨細胞分化的臍帶間充質干細胞的制備方法，該方法得到的向軟骨細胞分化的間充質干細胞，及其制備的藥物在治療骨關節炎中的應用。其中，所述方法包括在15ml尖底離心管中使用小球法誘導培養間充質干細胞，并且每隔約24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管底分離；誘導分化培養基為高糖DMEM加入100μg/ml丙酮酸鈉，10ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml維生素C，40μg/ml脯氨酸，1×ITS+1premix。采用本發明專利技術的方法構建的無支架軟骨可用于受損關節軟骨的修復。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及干細胞
，具體來說，涉及向軟骨誘導的UC-MSCs的制備方法及其在骨關節炎中的應用。
技術介紹
關節軟骨是一種負重結締組織，常因腫瘤，運動、退行性變或老年性疾病造成損傷；然而關節軟骨自身修復能力有限，給臨床治愈軟骨缺損造成了很大困難。近些年出現了多種治療軟骨缺損的方法，包括自體軟骨細胞移植、微裂縫和鑲嵌成形術，但這些方法各自都有其局限性。近年來，組織工程軟骨成為軟骨修復研究的新熱點，間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是其當前最有前景的種子細胞。MSCs是來源于發育早期中胚層和外胚層的一類多能干細胞，最初在骨髓中發現。目前MSCs的主要來源為成人骨 髓，但成人骨髓源MSCs細胞數量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且供者MSCs的采集須行骨髓穿刺術，來源受到限制。研究發現，MSCs在人胎兒和出生后多種組織廣泛存在，包括骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝和臍血等。在前一個國家自然基金《臍帶間充質干細胞生物特性、造血支持研究及在移植中的應用》(30570905)的資助下，我們應用改進的膠原酶和胰酶相結合的酶直接消化法，通過磁珠篩選，從臍帶中獲得了大量的MSCs。并建立了一種可以分離擴增臍帶MSCs的方法，且操作簡單易行(ZL200910242375. 8)。根據本方法，90%足月臍帶可以分離出MSCs，獲得I X IO9 MSCs細胞，充分滿足臨床和實驗研究的需要。現有技術尚沒有將臍帶源間充質干細胞向軟骨誘導分化的嘗試，我們將臍帶源間充質干細胞作為我們的種子細胞，將其誘導分化為無支架軟骨，并對其修復受損關節軟骨的能力進行了研究，具有重要的臨床指導意義。
技術實現思路
本專利技術在第一方面提供了一種誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其中，在15ml尖底離心管中使用小球法誘導培養間充質干細胞，并且每隔約24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管底分離。在一個特定的實施方案中，使用的誘導分化培養基為高糖DMEM加入100 μ g/ml丙酮酸鈉，10 ng/ml TGF^ 3，100 nM地塞米松，25 48/1111維生素(，40 μ g/ml脯氨酸，IXITS + I premix ;誘導分化培養時間為21天。優選地，所述間充質干細胞為臍帶源間充質干細胞。在本專利技術的第二個方面，提供了根據本專利技術的方法制備的向軟骨細胞分化的間充質干細胞。優選地，所述間充質干細胞為臍帶源間充質干細胞。在本專利技術的第三個方面，提供了向軟骨細胞分化的間充質干細胞在制備治療骨關節炎的藥物中的應用。優選地，所述間充質干細胞為臍帶源間充質干細胞。本專利技術具有如下優點 I.采用小球法誘導培養間充質干細胞，可以制得無支架軟骨，每隔約24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管底分離，保證了細胞球與誘導分化培養基充分接觸，細胞球中的間充質干細胞分化狀態均一。2.誘導分化培養基中使用TGFP 3代替了常用的TGFP 1，達到了更好的誘導效果O 3.臍帶源間充質干細胞相對于常規的骨髓源間充質干細胞分離制備簡便，來源豐富。附圖說明圖I向軟骨誘導分化21天后的UC-MSCs小球的甲苯胺藍染色結果，紫紅色證明為軟骨細胞。圖2大鼠骨關節炎模型經向軟骨誘導的UC-MSCs細胞懸液治療后的HE染色結果。A正常對照組；B模型組；C關節腔內細胞懸液治療組I ;D關節腔內細胞懸液治療組2 ；E尾靜脈注射細胞懸液治療組3 ； F尾靜脈注射細胞懸液治療組4。具體實施例方式實施例I臍帶源間充質干細胞向軟骨細胞誘導 I.MSC生長培養基單層擴增臍帶源間充質干細胞 MSC生長培養基(每75平方厘米培養瓶中加入13. 5ml DF12，10%人血清，20 ng/mlEGF、5ng/ml FGF2)培養P3代臍帶源間充質干細胞(UC-MSCs)，細胞生長達到70-80%融合，用D-Hank’s洗液洗兩遍后，加入I. 5ml胰酶-EDTA (O. 25%胰酶-O. 02% EDTA)進行消化，顯微鏡下觀察，細胞呈現圓球狀態時，用I. 5ml人血清終止消化，將細胞吸入50毫升離心管中，充分混勻后，取200微升計數確定細胞數量，其余細胞懸液離心，IOOOrpm, IOmin0倒掉離心后的上清，以1:3的比例傳代，培養至P4代，細胞生長達到70-80%融合，用D-Hank’ s洗液洗兩遍后，加入I. 5ml胰酶-EDTA進行消化，顯微鏡下觀察，細胞呈現圓球狀態時，用I.5ml人血清終止消化，將細胞吸入50毫升離心管中，充分混勻后，離心，IOOOrpm, IOmin0倒掉離心后的上清,加入30ml D-hank’ s洗液，混勻后再次離心，倒掉上清，再次加入30mlD-hank’s洗液,混勻后,取出200微升計數,其余細胞懸液離心，IOOOrpm, lOmin。離心后去掉上清。2. MSC生長培養基重懸細胞，調整細胞濃度至IXlOfVml個細胞。3. Pellet (小球法)培養細胞將Iml含有I X IO6個細胞的細胞懸液加入15ml尖底離心管中，離心(240g，5分鐘)，將離心管放入37°C，5% CO2細胞培養箱中，約24小時后，輕輕晃動離心管，使細胞球與管底分離，之后換加入誘導分化培養基(高糖DMEM加入100 yg/ml 丙酮酸鈉，10 ng/ml TGF^ 3，100 nM 地塞米松，25 48/1111維生素(，40 μ g/ml 月甫氨酸，IX ITS + I premix (10 ug/ml Insulin, 5.5 ug/ml transferrin, 5ng/mlselenium, 5. 35 μ g/ml linoleic acid),每隔24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管壁分離，每兩天更換一次軟骨分化培養基。21天后，取出小球，甲苯胺藍染色，如圖I所示，紫紅色證明為軟骨細胞。實施例2向軟骨誘導的UC-MSCs在骨關節炎中的應用 將實施例I中得到的向軟骨誘導的細胞球在離心管中用3ml 2%(w/v)的II型膠原酶消化半小時后，1000rpm，5min離心后，用與實施例I同樣的誘導分化培養基重懸后接種于底面積為25 cm2的培養瓶中擴增培養，長滿后用O. 5ml胰酶-EDTA消化，制成向軟骨誘導的UC-MSCs細胞懸液。選健康雄性Wistar大鼠，體重200±50 g，60只。隨機分為⑴關節腔內注射向軟骨誘導的UC-MSCs細胞懸液治療組I J2)關節腔內注射向軟骨誘導的UC-MSCs細胞懸液治療組2 ;⑶尾靜脈注射向軟骨誘導的UC-MSCs細胞懸液治療組3 ;⑷尾靜脈注射向軟骨誘導的UC-MSCs細胞懸液治療組4 ;(5)對照組(關節腔內注射細胞懸液溶劑)；(6)模型組；(7)正常組，其中前四組每組10只，后三組每組6只。造模方法為按0.3 ml/100 g腹腔注射10 %的水合氯醛，麻醉后，大鼠雙側膝關節注射4 %木瓜蛋白酶泊洛沙姆磷酸緩沖溶液，將下肢置 于50°C自制烤箱里2h，結束后即完成造模。造模完成后的第I周為O周，分別于0、2、4周注射細胞懸液。關節腔內注射組I和尾靜脈注射組3每只注射100 μ I 4X IO7個/ml，關節腔內注射組2和尾靜脈注射組4每只注射1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其中，在15ml尖底離心管中使用小球法誘導培養間充質干細胞，并且每隔約24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管底分離。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉擁軍，王立華，許放，董方，
申請(專利權)人：天津和澤干細胞科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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