本發明專利技術涉及C型鈉肽在促進牛卵母細胞體外成熟中的應用。本發明專利技術提供一種牛卵母細胞體外成熟培養液，以常規培養液為基質，所述基質中含有C型鈉肽。本發明專利技術通過CNP體外抑制牛卵母細胞減數分裂，前成熟處理后促進了卵母細胞核成熟和胞質成熟同步，提高了體外發育能力，能夠成為新型的減數分裂抑制劑藥物在畜牧業生產上推廣應用，加速良種選育及擴繁技術體系。本發明專利技術CNP作為生物活性的肽類物質，對卵母細胞的毒害作用小于化學合成的減數分裂抑制物質。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，尤其涉及C型鈉肽在促進牛卵母細胞體外成熟中的應用。
技術介紹
在家畜繁殖上，廣泛采用非激素刺激卵巢來源卵母細胞體外成熟后生產動物胚胎，因此體外卵母細胞成熟是一個重要的平臺技術用于育種、克隆及轉基因動物生產。 目前，優質種牛數量少、繁育速度慢、生產性能落后是制約我國養牛業健康、可持續發展的關鍵因素。牛的體細胞克隆胚胎(NTEs)以及體外受精胚胎(IVFEs)的細胞數，均明顯低于體內胚胎，這反映了牛的體外培養體系還不理想。牛體外受精(in vitroFertilization, IVF)胚胎質量是影響胚胎移植妊娠率和移植后后代犢牛成活率的重要因素。近年來關于牛卵母細胞體外成熟培養(IVM)方面取得了較大進展。專利CN102140435A、CN 101591637A、CN 100432219C公開了提高牛卵母細胞體外成熟的方法或新的培養液。但均是用于促進減數分裂恢復，促進卵母細胞體外生長成熟。這對于卵母細胞從卵泡轉到培養液中后，在胞質未完全成熟的情況下提前恢復減數分裂，從而影響卵母細胞的發育能力。為了提高卵母細胞的體外發育能力，許多學者模擬體內環境開發了卵母細胞體外兩段成熟培養方法，即通過體外使用減數分裂抑制劑暫時可逆的阻止卵母細胞減數分裂恢復，同時促進卵母細胞生長發育，增強胞質成熟，然后移出減數分裂抑制環境，進行體外成熟。這種方法目的延長顆粒細胞與卵母細胞通過間隙連接進行物質和信息交流的時間，促進卵母細胞積累豐富的mRNA和蛋白質。但是，這些研究結果顯示通過使用減數分裂抑制劑并沒有提高牛卵母細胞體外發育能力，甚至產生了不利的影響(Gilchrist RB, et al.Comparison of oocyte factors and transforming growthfactor-beta in the regulation of DNA synthesis in bovine granulosa cells. MolCell Endocrinol, 2003, 201:87 - 95. Lonergan P, et al. Bovine blastocyst productionin vitro after inhibition of oocyte meiotic resumption for 24h. J ReprodFertil, 1997，109:355 - 365.)。C型鈉肽(CNP, C-type natriuretic peptide, C型鈉尿肽，C_型利鈉肽)為鈉肽家族成員，一般認為以自分泌和旁分泌的方式調控動物心血管、神經系統、內分泌系統及繁殖性能。功能性C型鈉肽由22個氨基酸組成，是生理活性物質，相對于化學合成的減數分裂抑制劑危害性應較小，用于卵母細胞體外成熟培養體系的建立可能具有一定的作用。《Granulosa Cell Ligand NPPC and Its Receptor NPR2 Maintain MeioticArrest in Mouse Oocytes’》(Science, 2010)文中提出一種模型來解釋小鼠卵母細胞保持減數分裂的機制。通過NPPC (C型利鈉肽前體)和NPR2 (由卵丘細胞表達的一種鳥苷酸環化酶)突變體小鼠來驗證NPPC和NPR2在保持卵母細胞減數分裂停滯的作用，突變體小鼠出現了促性腺激素非依賴性的減數分裂的恢復。但上述只是一種機制研究，對于CNP能否抑制牛等家畜卵母細胞減數分裂，并用于體外受精、胚胎生產尚不確定，目前尚無此方面的研究報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種牛卵母細胞體外成熟培養液。本專利技術另一目的是提供一種促進牛卵母細胞體外成熟的方法。本專利技術再一目的是提供C型鈉肽在促進牛卵母細胞成熟中的應用及C型鈉肽在制備用于促進牛卵母細胞體外成熟藥物/減數分裂抑制劑藥物中的應用。所述牛卵母細胞體外成熟培養液以常規培養液為基質，所述基質中含有C型鈉 肽。優選地，所述體外成熟培養液每IOOOmL組成為C 型鈉肽 200nM。TCM199 補足至 1000mL。牛卵母細胞采集后在添加CNP的組織培養液內前成熟處理6h，然后在成熟液內成熟24-28h，成熟后的卵母細胞進行體外受精，然后進行體外胚胎培養。具體地，包括以下步驟I)采集牛卵母細胞；2)將牛卵母細胞在所述牛卵母細胞體外成熟培養液中培養；3)牛卵母細胞體外成熟培養。其中，步驟I)中所述牛卵母細胞為卵丘-卵母細胞復合體。其中，步驟2)中所述培養時間為6h ;所述培養液為TCM199培養液。其中，步驟3)中所述培養的培養液為添加FSH 10 μ g/ml, LHl μ g/ml, E2I μ g/ml,EGF lOng/ml, 10%FBS 的 TCM199 培養液；培養時間為 24_28h。其中，成熟培養后的卵母細胞還用于體外受精或體外胚胎生產。本專利技術的有益效果I)本專利技術首次采用兩段體外成熟培養法，應用CNP前成熟處理牛卵母細胞，促進核成熟和胞質成熟同步，提高了體外發育能力，能夠成為新型的減數分裂抑制劑藥物在畜牧業生產上推廣應用。2)本專利技術充分利用屠宰場卵巢卵母細胞資源，加速良種選育及擴繁技術體系，大幅度提高育種效率和技術水平。3)本專利技術CNP為生物活性的肽類物質，對卵母細胞的毒害作用小。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實驗用卵巢采自河北省大廠縣屠宰場，C型鈉肽購自美國Sigma公司。實施例I卵母細胞成熟培養(I)卵母細胞采集使用含有抽卵液(TCM199+l%PVA+200uM IBMX+1%雙抗)的IOml注射器從屠宰場獲取的牛卵巢表面抽取直徑3-8mm卵泡。將吸取卵母細胞后的吸卵液放入IOOmL國產培養皿中，在體視顯微鏡下挑選出A級(胞質均勻3層及以上緊密卵丘顆粒細胞包裹)和B級(胞質均勻少于3層緊密卵丘顆粒細胞包裹或部分裸露)卵母細胞用于體外前成熟培養。(2)卵母細胞前成熟處理將挑選出的A、B級卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes,COCs)在洗卵液(TCM199+l%PVA+200uM IBMX+1%雙抗)中清洗3次，含有CNP的前成熟液(添加200nM濃度CNP的TCM199培養液)清洗2次，然后放入預先在C O2培養箱中平衡2h的前成熟培養液中培養(四孔板培養，500 μ I體積成熟液，50枚左右卵母)，培養條件為含5%C02的空氣，溫度39°C，飽和濕度，培養時間為6h。前成熟后一部分卵母細胞脫去顆粒細胞，然后DAPI染色在顯微鏡下觀察CNP對牛卵母細胞減數分裂抑制情況(未添加CNP的前成熟液培養的卵母細胞為對照)，觀察卵母細胞維持在生發泡(GV)階段的數目，前成熟后的卵母細胞進行下一步成熟培養用于檢測發育能力。結果見表I。表IC型鈉肽前處理后對體外牛卵母細胞減數分裂的影響處理卵母細胞數 GV數(%)GVBD數(%)Control9151(56 + 2.6°) 40(44 + 2.6°)CNP(200nM) 9479(81. 5 + 2. Ib) 18(21. 3 + 2. Ib)注同列不同字母表示差異顯著(P〈0. 01)實驗結果表明CNP處理6h后抑制了牛卵母細胞減數分本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種牛卵母細胞體外成熟培養液，其特征在于，以常規培養液為基質，所述基質中含有C型鈉肽。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：田見暉，賈振偉，張家新，安磊，吳中紅，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：
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