一種體外誘導胚胎干細胞分化成為神經細胞方法技術

本發明專利技術屬于生物醫學領域，涉及一種體外誘導胚胎干細胞分化成為神經細胞方法，尤其涉及嘌呤衍生物Purmorphamine誘導Olig2+-GFP+-mES的神經細胞分化的方法及其用途。本發明專利技術采用擬胚體介導的神經誘導法，以Olig2-GFP+-mES作為細胞模型，以嘌呤衍生物Purmorphamine結合全反式維甲酸定向誘導所述的Olig2-GFP+-mES細胞分化為脊髓運動神經元和少突膠質前體細胞；經實驗證實，所述的Purmorphamine可作為SHH的替代物，有效地誘導Olig2+-GFP+-mES分化為高純度、有功能的脊髓運動神經元和少突膠質細胞，并引起相關基因表達改變；移植實驗結果證實，所誘導的神經細胞能促進大鼠脊髓損傷后功能和形態的部分恢復，具有促進脊髓損傷后再生和功能重建的作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫學領域，涉及神經細胞誘導的方法，具體涉及，尤其涉及嘌呤衍生物(Purmorphamine)誘導01ig2+-GFP+-mES的神經細胞分化的方法及其用途。
技術介紹
脊髓損傷(Spinal cord injury, SCI)是臨床常見的外傷性疾患之一。SCI的發生大多源于交通傷、墜落傷或運動傷等，近年呈上升趨勢。SCI —旦形成，常常導致嚴重的行為功能障礙，給患者、家庭和社會帶來極大負擔。近年來，再生醫學給脊髓損傷的治療帶來新的希望。胚胎干細胞(ESC)以其具有很強的增殖和分化能力，可被大量地誘導分化成為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞等優勢，成為再生醫學移植供體的理想來源。但由于 胚胎干細胞直接移植體內具有形成畸胎瘤的危險，因此應用胚胎干細胞移植治療脊髓損傷一般先在體外誘導分化出神經前體細胞或神經細胞，然后再移植進脊髓組織，具體而言，目前臨床實施胚胎干細胞移植治療脊髓損傷的過程包括如下兩部分一是體外誘導胚胎干細胞分化成為純度高、數量多、有功能的神經細胞；二是移植到脊髓內的細胞可遷移、增殖以及與宿主組織形成很好的整合，從而發揮功能。當前，胚胎干細胞的體外誘導分化方法中，還存在著誘導分化的細胞純度低、數量少等問題。神經分化的過程受多種信號通路的調控，其中音渭酸(Sonic hedgehog, SHH)信號通路起著重要的作用。嘌呤衍生物Purmorphamine是小分子化合物，已經被證實能與SHH信號通路中的Smoothened結合，激活SHH信號通路，被認為是SHH的替代物，在發育中起著重要的作用。目前已知，Olig基因是堿性螺旋一環一螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉錄因子家族的一員，包括Oligl和01ig2兩種，最初被認為是少突膠質細胞或其前體細胞特異性表達的基因而得名；01igl特異性地參與少突膠質細胞的發育，而01ig2早在胚胎8. 5天時少突膠質細胞尚未發生時就已經表達。有研究表明，01ig2在脊髓胚胎發育中，位于腹側的2/3區域，在SHH(胚胎發育過程中由脊索產生的一種因子)的誘導下早期能促進運動神經元、抑制V2區中間神經元的生成；后期則促進少突膠質細胞，抑制星形膠質細胞的生成，揭示01ig2與其它轉錄因子的協同作用共同調節神經元和少突膠質細胞的順序發生。目前，尚未見有關應用Purmorphamine替代SHH,誘導胚胎干細胞分化,獲得純度高、數量多、有功能的脊髓運動神經元和少突膠質細胞，以及Purmorphamine替代SHH,能否引起SHH信號通路、背-腹軸通路、運動神經元和少突膠質細胞發育中相關基因的變化，同時誘導分化的少突膠質前體細胞移植到脊髓損傷組織內，能否與宿主整合，進而遷移、分化來發揮修復損傷的作用的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種誘導神經細胞的方法，具體涉及，尤其涉及嘌呤衍生物(Purmorphamine)誘導01ig2+-GFP+-mES的神經細胞分化的方法。本專利技術的進一步目的是提供所述的方法在制備修復脊髓損傷的制劑中的用途。本專利技術采用擬胚體介導的神經誘導法，以01 i g2-GFP+-mES作為細胞模型，利用該細胞系在神經誘導分化過程中表達少突膠質細胞轉錄因子2 (Oligodendrocytetranscription factor 2, 01ig2)、并能方便觀測到綠色突光蛋白(Green FluorescentProtein, GFP)的表達,從而,提供Purmorphamine結合低濃度的全反式維甲酸定向誘導分化為脊髓運動神經元和少突膠質前體細胞的方法。本專利技術的目的通過下述技術方案實現一、建立 01ig2+-GFP+-mES 細胞模型 在小鼠胚胎干細胞的01ig2基因上轉入GFP蛋白建立01ig2+-GFP+-mES細胞模型。采用無血清培養方式，以不同濃度的Purmorphamine誘導擬胚體(EBs),通過細胞培養、免疫細胞化學、FACs和RT-PCR等方法觀察其對胚胎干細胞定向分化為脊髓運動神經元和少突膠質細胞的作用。實驗結果顯示，Purmorphamine可以完全替代SHH促進胚胎干細胞向神經細胞分化；促進01ig2基因的表達；從而促進在EB8D后向脊髓運動神經元分化，分化率超過50%，引起與脊髓運動神經元相關基因的表達變化；促進在EB12D后向少突膠質細胞分化，分化率超過80%，引起與少突膠質細胞相關基因、背-腹軸通路和SHH信號通路相關基因的表達變化。二、建立大鼠脊髓撞擊傷模型證實獲得的細胞移植后的作用應用NYU-Impactor II建立大鼠脊髓撞擊傷模型，將Purmorphamine誘導分化01ig2+-GFP+-mES獲得的01ig2+-GFP+-0PC移植到脊髓損傷組織內，通過免疫組織化學、透射電鏡、Western blot、行為學和神經電生理等方法觀察移植細胞是否促進脊髓功能的恢復，證實獲得的細胞移植在脊髓損傷恢復中所起的作用。本專利技術的實驗結果顯示，Purmorphamine作為SHH的替代物，能有效地誘導01ig2+-GFP+-mES分化為高純度、有功能的脊髓運動神經元和少突膠質細胞，并引起相關基因的改變；移植所誘導的01ig2+-GFP+-0PC可以促進大鼠脊髓損傷后功能和形態的部分恢復，從而促進脊髓損傷后再生和功能重建的作用，為臨床應用細胞移植治療脊髓損傷提供一定的實驗依據。本專利技術中，所述的01ig2+-GFP+-mES是利用遺傳工程的方法，通過四環素誘導表達系統，在小鼠胚胎干細胞(Mouse embryonic stem cell,mESC)的01ig2基因座上插入GFP制成；其在神經誘導分化過程中，能直觀地判斷誘導的神經細胞的出現和篩選，也便于細胞移植時，通過觀察GFP的表達來確定移植細胞在宿主體內的遷移、分化和增殖等。本專利技術中，所述的01ig2+-GFP+-0PC是由Purmorphamine誘導分化01ig2+-GFP+-mES 制得。本專利技術的體外誘導胚胎干細胞分化成為神經細胞方法，是采用擬胚體介導的神經誘導法，即綜合RA誘導法和五步法使01ig2+-GFP+-mES向脊髓的運動神經元和少突膠質細胞分化的方法，其包括以下步驟①將01ig2+-GFP+-mES放入含有白血病抑制因子(LIF，20u/ml)的胚胎干細胞培養基懸浮培養2d ；②放入含有全反式維甲酸RA (O. 5 μ Μ)和不同濃度Purmorphaine的神經分化培養基中培養4d ；③放入含有bFGF (10ng/ml)的神經分化培養基分別培養2d和6d，采用熒光激活的細胞分選(FACs)篩選01ig2+-GFP+-陽性細胞；④分別在神經元培養基和少突膠質細胞培養基繼續培養，誘導生成脊髓運動神經元和少突膠質細胞。本專利技術方法的步驟④中，所述的在神經元培養基中培養為貼壁培養7 14d ;所述的在少突膠質細胞培養基培養為貼壁培養14d。本專利技術的方法中,Purmorphamine通過影響SHH信號通路和背-腹軸通路中的相關基因表達，分別通過上調運動神經元和少突膠質細胞的相關基因來誘導01ig2+-GFP+-mES定向分化為脊髓運動神經元和少突膠質細胞； 誘導分化的01ig2+-GFP+_0PC移植到大鼠本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種體外誘導胚胎干細胞分化成為神經細胞方法，其特征在于，采用擬胚體介導的神經誘導法，以Olig2？GFP+？mES作為細胞模型，以嘌呤衍生物Purmorphamine結合全反式維甲酸定向誘導所述的Olig2？GFP+？mES細胞分化為脊髓運動神經元和少突膠質前體細胞；包括下述步驟：①將Olig2+？GFP+？mES放入含有白血病抑制因子LIF的胚胎干細胞培養基懸浮培養2天；②放入含有全反式維甲酸RA和嘌呤衍生物Purmorphaine的神經分化培養基中培養4天；③放入含有bFGF的神經分化培養基分別培養2天和6天，采用熒光激活的細胞篩選Olig2+？GFP+？陽性細胞；④分別在神經元培養基和少突膠質細胞培養基繼續培養，誘導生成脊髓運動神經元和少突膠質細胞。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫燕，彭裕文，張素春，李瑞錫，
申請(專利權)人：復旦大學，
類型：發明
國別省市：