本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種3T3-L1脂肪前體細胞誘導(dǎo)分化方法，包括：3T3-L1前脂肪細胞株的復(fù)蘇、3T3-L1前脂肪細胞株的培養(yǎng)、3T3-L1前脂肪細胞株的傳代和3T3-L1前脂肪細胞株的誘導(dǎo)分化。使用本發(fā)明專利技術(shù)上述方法對3T3-L1脂肪前體細胞進誘導(dǎo)分化至誘導(dǎo)后8天，視野中大約90%細胞分化為典型的成熟脂肪細胞，細胞體積增大，胞體變圓，胞漿內(nèi)脂滴明顯，部分融合成較大脂滴。本發(fā)明專利技術(shù)具有較好的分化效果和分化效率。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是一種3T3-L1脂肪前體細胞誘導(dǎo)分化方法。
技術(shù)介紹
脂肪前體細胞是一類能夠增殖并向脂肪細胞分化的特異化的前體細胞。它是成熟脂肪細胞的前體。在開始向脂肪細胞分化前，脂肪前體細胞形態(tài)上類似成纖維細胞，呈長梭形。開始分化后，脂肪前體細胞逐漸喪失長梭形的形態(tài)，向圓球形轉(zhuǎn)變，同時細胞內(nèi)甘油三脂的含量逐漸上升，細胞骨架蛋白等的含量下降。細胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，脂肪前體細胞逐漸向成熟脂肪細胞轉(zhuǎn)化。由于脂肪前體細胞不含脂滴，體積小，有促血管生成特性，在細胞的收集與移植過程中比成熟的脂肪細胞更能耐受缺血與創(chuàng)傷，尤其在脂肪移植后的缺血期，使單個細胞比塊狀脂肪更易通過細胞融合而成活。研究顯示抑制RAS可以減少糖尿病的發(fā)病及并發(fā)癥的產(chǎn)生，但多項研究并未發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血液中腎素或是血管緊張素II有所增高，隨著多組織包括胰腺組織、脂肪組織、心臟組織中表達RAS各成分的發(fā)現(xiàn)，人們越來越關(guān)注局部RAS的激活是否在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。研究證實人類脂肪細胞可產(chǎn)生RAS的各種成分包括血管緊張素原、腎素或腎素樣活性物質(zhì)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血管緊張素II I型和血管緊張素II 2型受體。近年來的研究更發(fā)現(xiàn)，人類脂肪組織還可表達腎素受體及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2。脂肪組織其釋放的血管緊張素原不僅是局部RAS的重要來源，更是循環(huán)RAS的重要組成成分。研究結(jié)果提示脂肪組織局部存在幾乎所有RAS的相關(guān)組分，其不僅作用于局部組織更是作為循環(huán)RAS的重要組成作用于全身各組織。因此其對糖尿病的發(fā)病及并發(fā)癥發(fā)生也有重要影響。由于脂肪組織在機體分布廣泛，包括皮下脂肪、內(nèi)臟周圍脂肪、血管周圍脂肪等，因此局部RAS其作用范圍廣泛。腎素-血管緊張素系統(tǒng)不僅可反饋作用于脂肪細胞，影響其增生分化及脂肪代謝。此外脂肪細胞分泌的血管緊張素II還可以促進各種炎癥因子如白介素-6、TNF- α，I趨化分子-1 (ICAM-1)，血管細胞趨化分子_1 (VCAM-1)等的表達和釋放，從而參與糖尿病發(fā)病及并發(fā)癥的病理生理過程。然而脂肪組織中RAS的表達變化調(diào)節(jié)因素多樣，機制尚不明確。且由于作為血管緊張素前體的血管緊張素原在脂肪組織中大量表達，許多研究主要集中在脂肪組織內(nèi)血管緊張素原的生成、調(diào)節(jié)和釋放方面，而對RAS其他各成分的變化并不十分明確。為了建立脂肪前體細胞培養(yǎng)體系，研究局部脂肪組織中RAS的激活在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起到作用具有現(xiàn)實意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種脂肪前體細胞誘導(dǎo)分化方法，用于研究局部脂肪組織中RAS的激活在糖尿病及其并發(fā)癥的 發(fā)生發(fā)展中起到作用。一種3T3-L1脂肪前體細胞誘導(dǎo)分化方法，包括以下步驟(一)3T3-L1前脂肪細胞株的復(fù)蘇從液氮種取出細胞株，立即置于37°C水浴箱中，至細胞液完全溶解時取出，將復(fù)蘇的細胞加入在室溫IOOOrpm離心5min，棄去上清，再加入培養(yǎng)液，吹打重懸，將重懸的細胞及培養(yǎng)液吸入培養(yǎng)皿中，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及數(shù)量，將培養(yǎng)皿置于5%C02的37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(二)3T3-L1前脂肪細胞株的培養(yǎng)顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭行，透亮，細胞每2天更換I次培養(yǎng)液，傾斜培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)液用移液管移去，沿壁加入培養(yǎng)液；(三)3T3-L1前脂肪細胞株的傳代顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭形或多角形，細胞密度約80%，傾斜培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)液用移液器移去，沿壁加入溫?zé)岬腜BS溶液6ml，晃動培養(yǎng)皿后，用移液器移去，重復(fù)一次，加入Trypsin進行消化，顯微鏡下見細胞由不規(guī)則多角形或梭形收縮成圓形，過程約30秒，加入培養(yǎng)液終止消化，用移液器吹打，使細胞脫離培養(yǎng)皿底，吸入離心管中，IOOOrpm離心4min，傾去上清，加入培養(yǎng)液，吹打使細胞分散；取含有細胞的培養(yǎng)液加入孔板，置于5%C02的37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(四)3T3_L1前脂肪細胞株的誘導(dǎo)分化上述傳代細胞培養(yǎng)至完全長滿后3天開始誘導(dǎo)分化；加入含有誘導(dǎo)劑(1. OuM地塞米松，1. OmM IBMX,1. 7uM胰島素)和小牛血清(10%)的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)2天；顯微鏡下見少數(shù)細胞呈圓形，并有脂滴出現(xiàn)；加入僅有1. 7uM胰島素(1. 7uM)、小牛血清(10%)的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；繼續(xù)誘導(dǎo)6天后，顯微鏡下見細胞基本呈圓形，細胞內(nèi)含有多個較大的脂滴，即分化為成熟的脂肪細胞。使用本專利技術(shù)上述方法對3T3-L1脂肪前體細胞進誘導(dǎo)分化至誘導(dǎo)后8天，視野中大約90%細胞分化為典型的成熟脂肪細胞，細胞體積增大，胞體變圓，胞漿內(nèi)脂滴明顯，部分融合成較大脂滴。可見本專利技術(shù)具有較好的分化效果和分化效率。附圖說明 圖1為成熟的3T3-L1脂肪細胞油紅O染色結(jié)果(20X)。具體實施例方式本實施例用到的各種試劑(I)各PCR引物上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，用DEPC水配成IOmmoI/L濃度，-20°C保存。(2)油紅O染液0. 25g油紅O加入IOOml異丙醇，56°C溶解I小時，冷卻后過濾作為儲存液。使用時，取上述儲存液與ddH20以6:4比例混勻，靜置IOmin即為使用液。(3) IOmM地塞米松儲存液(10000X ):以無水乙醇溶解后，_20°C儲存。(4)0. 5IBMX 儲存液(1000X):以 DMSO 溶解后，_20°C儲存。(5)磷酸緩沖液(PBS):用10XPBS儲存液，用超純水以1:9比例配置，pH值調(diào)到7.2，高溫滅菌后備用。(6)甲醛固定液將40%甲醛10ml、L Ig氯化鈣加入90mlddH20中，調(diào)節(jié)PH至7. O。(7)3T3_L1 脂肪前體細胞，購自美國 ATCCXAmerican Type Culture Collection)。誘導(dǎo)分化具體包括(一)3T3-L1前脂肪細胞株的復(fù)蘇(I)從液氮種取出細胞株，立即置于37°C水浴箱中，至細胞液完全溶解時取出；(2)將復(fù)蘇的細胞加入裝有IOml培養(yǎng)液的15ml離心管中，室溫IOOOrpm離心5min ；(3)棄去上清，再加入6ml培養(yǎng)液，吹打重懸；(4)將重懸的細胞及培養(yǎng)液吸入35mm培養(yǎng)皿中；(5)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及數(shù)量；(6)將培養(yǎng)皿置于5%C02的37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(二)3T3-L1前脂肪細胞株的培養(yǎng)(I)顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭行，透亮，細胞每2天更換I次培養(yǎng)液；(2)傾斜培養(yǎng)皿,將培養(yǎng)液用移液管移去,沿壁加入培養(yǎng)液；(三)3T3-L1前脂肪細胞株的傳代(I)顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭形或多角形，細胞密度約80% ；(2)傾斜培養(yǎng)皿,將培養(yǎng)液用移液器移去；(3)沿壁加入溫?zé)岬腜BS溶液6ml，晃動培養(yǎng)皿后，用移液器移去，重復(fù)一次；(4)加入ImlTryps in進行消化，顯微鏡下見細胞由不規(guī)則多角形或梭形收縮成圓形，過程約30秒；(5)加入2m培養(yǎng)液終止消化；(6)用移液器吹打，使細胞脫離培養(yǎng)皿底，吸入離心管中，IOOOrpm離心4min ；(7)傾去上清，加入40ml培養(yǎng)液，吹打使細胞分散；(8)取含有細胞的培養(yǎng)液加入12孔板，每孔加入1ml，置于5%C02的37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(四)3T3-L1前脂肪細胞株的誘導(dǎo)分化( I)上述傳代細胞培養(yǎng)至完全長滿后3天開始誘導(dǎo)分化；(2)加入含有誘導(dǎo)劑(1. OuM地塞米松，1. OmM本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種3T3?L1脂肪前體細胞誘導(dǎo)分化方法，其特征在于，包括以下步驟:（一）3T3?L1前脂肪細胞株的復(fù)蘇：從液氮種取出細胞株，立即置于37℃水浴箱中，至細胞液完全溶解時取出，將復(fù)蘇的細胞加入在室溫1000rpm離心5min，棄去上清，再加入培養(yǎng)液，吹打重懸，將重懸的細胞及培養(yǎng)液吸入培養(yǎng)皿中，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及數(shù)量，將培養(yǎng)皿置于5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；（二）3T3?L1前脂肪細胞株的培養(yǎng)：顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭行，透亮，細胞每2天更換1次培養(yǎng)液，傾斜培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)液用移液管移去，沿壁加入培養(yǎng)液；（三）3T3?L1前脂肪細胞株的傳代：顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭形或多角形，細胞密度約80%，傾斜培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)液用移液器移去，沿壁加入溫?zé)岬腜BS溶液6ml，晃動培養(yǎng)皿后，用移液器移去，重復(fù)一次，加入Trypsin進行消化，顯微鏡下見細胞由不規(guī)則多角形或梭形收縮成圓形，過程約30秒，加入培養(yǎng)液終止消化，用移液器吹打，使細胞脫離培養(yǎng)皿底，吸入離心管中，1000rpm離心4min，傾去上清，加入培養(yǎng)液，吹打使細胞分散；取含有細胞的培養(yǎng)液加入孔板，置于5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；（四）3T3?L1前脂肪細胞株的誘導(dǎo)分化：上述傳代細胞培養(yǎng)至完全長滿后3天開始誘導(dǎo)分化；加入含有誘導(dǎo)劑（1.0uM地塞米松，1.0mM?IBMX，1.7uM胰島素）和小牛血清（10%）的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)2天；顯微鏡下見 少數(shù)細胞呈圓形，并有脂滴出現(xiàn)；加入僅有1.7uM胰島素(1.7uM）、小牛血清（10%）的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；繼續(xù)誘導(dǎo)6天后，顯微鏡下見細胞基本呈圓形，細胞內(nèi)含有多個較大的脂滴，即分化為成熟的脂肪細胞。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種3T3-L1脂肪前體細胞誘導(dǎo)分化方法，其特征在于，包括以下步驟 (一)3T3-L1前脂肪細胞株的復(fù)蘇從液氮種取出細胞株，立即置于37°C水浴箱中，至細胞液完全溶解時取出，將復(fù)蘇的細胞加入在室溫IOOOrpm離心5min，棄去上清，再加入培養(yǎng)液，吹打重懸，將重懸的細胞及培養(yǎng)液吸入培養(yǎng)皿中，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及數(shù)量，將培養(yǎng)皿置于5%C02的37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (二)3T3-L1前脂肪細胞株的培養(yǎng)顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭行，透亮，細胞每2天更換I次培養(yǎng)液，傾斜培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)液用移液管移去，沿壁加入培養(yǎng)液； (三)3T3-L1前脂肪細胞株的傳代顯微鏡下見細胞貼壁，呈梭形或多角形，細胞密度約80%，傾斜培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)液用移液器移去，沿壁加入溫?zé)岬腜BS溶液6ml，晃動培養(yǎng)皿后，用移液器移去，重復(fù)一次，加入...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：寧光，方萍，湯正義，崔斌，王衛(wèi)慶，
申請(專利權(quán))人：上海市內(nèi)分泌代謝病研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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