本發明專利技術公開了生物檢測技術領域的一種血液同型半胱氨酸的檢測方法及試劑盒。此試劑盒包括盒體以及在盒體內的96孔板、HCY標準品、HCY特異性轉化酶、還原劑、緩沖液、顯色液A和顯色液B，此試劑盒利用rHCYase分解血中的HCY產生H2S，生產的H2S與二甲基對苯胺反應生產甲基藍，通過甲基藍生成量反應血液中HCY的含量。本試劑盒操作簡單，試劑穩定性好，重復性高，方法靈敏，適用于實驗室和臨床快速檢測HCY。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物檢測
，具體涉及一種血液同型半胱氨酸的檢測方法及試劑盒。
技術介紹
近十多年的研究證實,血液中高濃度的同型半胱氨酸(Homocysteine, HCY)是冠狀動脈疾病、腦血管及外周血管疾病的獨立危險因素。HCY是由蛋氨酸去甲基生成的一種含硫氨基酸，它在體內主要通過再甲基化、轉硫作用兩種途徑進行代謝其一，在蛋氨酸合成酶的催化作用下，以維生素B12為輔酶，以N5-甲基四氫葉酸為甲基供體，HCY被甲基化生成蛋氨酸。此過程的關鍵酶是以維生素B2為輔酶的亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)，該酶使N5，NlO-亞甲基四氫葉酸還原為N5-甲基四氫葉酸，其作用非常重要；其二，HCY與絲氨·酸結合，在胱硫醚-β-合成酶(CBS)催化作用下，以維生素Β6為輔酶，生成胱硫醚，后者再裂解為半胱氨酸和α -酮丁酸，參與代謝，形成轉硫化途徑。當上述代謝途徑受阻時，HCY在細胞內蓄積，并進入血液循環，引起慢性病理損害。參與HCY代謝的酶(如MTHFR和CBS)如有遺傳缺陷可導致嚴重的高HCY血癥，而由于營養因素導致的維生素B6、B12和葉酸的缺乏同樣可產生高HCY血癥。除遺傳、營養因素外，年齡、種族、生活習慣(如吸煙、飲酒、高蛋氨酸食物等)、藥物和某些疾病因素等也可以不同程度地影響血漿HCY水平。血漿中約75%的HCY與白蛋白結合，形成結合型HCY，其余的則主要以二硫鍵結合的HCY-HCY、HCY-半胱氨酸化合物形式存在，游離型只有I 2%以還原型HCY存在于血漿中。通常測定的是血漿中所有形式HCY總和，即總HCY(total Homocysteine, tHCY)。一般認為，血漿tHCY正常值參考范圍為5 151111101/1(高效液相色譜法)，當血楽· tHCY ^ 15 μ mol/L 時，即為高 HCY 血癥(Hyperhomocysteinemia, HHcy);當血衆tHcyMOymol/L時即超出腎閾值，可出現同型半胱氨酸尿，這種情況主要見于遺傳病。研究發現，男性血漿tHCY濃度介于9. O 14. 9 μ mol/L者，其患冠心病的危險性是低于9. O μ mol/L者的2倍，而高于14. 9 μ mol/L者，其危險性則增加6倍，因此，1995年建議理想的血衆tHcy濃度應低于10 μ mol/L2006年，美國高血壓協會(ASH)和腦卒中協會(ASA)發布了對于缺血性腦卒中和短暫腦缺血發作患者的卒中預防指南。在該指南里，高Hcy血癥被列為腦卒中的重要風險因子之一，并定義Hcy>10 μ mol/L即為高Hcy血癥，建議給予患者補充維生素B6、B12和葉酸。目前Hcy檢測方法有(I)同位素法通過14C標記的腺苷與tHcy縮合后，經色譜分離，液體閃爍計數放射強度來測定tHcy濃度。該法靈敏度高、特異性強，但由于操作繁瑣且有放射污染，雖經改良也未能推廣使用。(2)高效液相色譜法(HPLC)是目前比較成熟且可推廣使用的方法，方法學包括柱前衍生-HPLC-熒光檢測法，HPLC-柱后衍生-紫外檢測法或熒光檢測法和HPLC-電化學檢測法。目前已有tHcy全自動的HPLC-熒光檢測儀問世。但是操作較為復雜，不適用大樣本快速分析。(3)熒光偏振免疫檢測(FPLA)法，該方法靈敏度高，檢測速度快，但價格昂貴，故短時期內不易普及。檢測時，首先用二巰基蘇糖醇將結合型HCY還原出來，然后通過特異性的S腺苷HCY合成酶催化HCY轉變為S腺苷HCY，與作為示蹤物的熒光素標記S腺苷HCY類似物一起與特異性單克隆抗體競爭性結合，引起示蹤物偏光性改變，從而檢測出HCY濃度。(4)酶免疫測定法，這種方法也需要將HCY先轉化為S腺苷Hcy，然后加入辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體，最后加入辣根過氧化物酶的底物，并在450nm處檢測。加入蛋氨酸與半胱氨酸對檢測結果均無影響，無交叉反應。這種方法的檢測結果與HPLC檢測結果的相關系數達O. 986。(5)循環酶法是近年發展起來、可用于自動生化分析儀的一種技術，它使tHCY檢測更加快速、方便。其原理是結合的HCY (氧化形式)被還原成游離的HCY，在胱硫醚-β -合成酶的催化下和絲氨酸反應生成L-胱硫醚，后者被胱硫醚-β -裂解酶分解成HCY和丙酮酸，丙酮酸參與NADH顯色反應，生成的HCY再次參與第一步反應，如此循環。該方法與HPLC法相關性良好，無需樣本預處理，目前正被國內外廣泛采用。但是顯色反應，易受血液一些成分的干擾。本專利技術中應用的酶為陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸 Y -裂解酶(Methionine gamma-lyase),同通過 基因改造，構建原核表達系統，經純化制備而成，對HCY具有特異性，取名HCY特異性轉化酶(rHCYase)，經色譜純化技術，制備了高純度的rHCYase，rHCYase穩定性好，活性高，可用于HCY的檢測分析，反應簡單，檢測試劑穩定，適用于臨床HCY的分析。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術中的不足，提供一種血液同型半胱氨酸的檢測方法及試劑盒。本專利技術方法的HCY檢測其原理是利用HCY特異性轉化酶(rHCYase)分解血中的HCY產生H2S,生產的H2S與試劑二甲基對苯胺反應生產甲基藍，通過檢測甲基藍生成量反應血液中HCY的含量,如式(I)所示。 COOH ICOCH H2N-CHrHCYaseI-,士H 十 H2Oγ=。 4* H2S + NH3 I,2CH2 CH2I ICH^ SH“TT,|)...........................III II 顧 +圓—、人 MICl—I式(I)一種血液中同型半胱氨酸的檢測方法，包括以下步驟(I)準備工作將HCY標準品用緩沖液溶解分別配置濃度為50 μ mol/L、25 μ mol/L、10 μ mol/L、5 μ mol/L、2· 5 μ mol/L,O μ mol/L 的 HCY 溶液，臨用前 15 分鐘內配制；將還原劑用緩沖液溶解配制成濃度為I μ mol/L還原劑工作液^fHCY特異性轉化酶用緩沖液配制成濃度為O. 4-0. 6mg/ml的HCY特異性轉化酶工作液；(2)檢測在96孔板中分別加入HCY標準品和樣品，加入還原劑工作液還原Ih ；加入HCY特異性轉化酶工作液反應5min ;加入顯色液A，反應5min ;加入顯色液B，反應IOmin ；(3)標準曲線制備根據標準品濃度溶液在670nm的吸光度值制備標準曲線，然后計算樣品中HCY含量；或根據標準品濃度溶液在激發波長615nm，發射波長685nm的熒光強度制備標準曲線，計算樣品中HCY含量。所述HCY特異性轉化酶為陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸Y-裂解酶。所述還原劑為二硫蘇糖醇。所述緩沖液為250mM的磷酸鹽緩沖溶液，pH為8. 3，其中含磷酸吡多醛的濃度為 IOuM, Triton X-100的濃度為O. 05wt%，三羧乙基膦(TCEP)的濃度為ImM。所述顯色液A為濃度為I. 5M的H2SO4溶液，其中含二甲基對苯胺濃度為20mM。所述顯色液B為20mM磷酸緩沖液，其中含鐵氰化鉀濃度為5mM。根據上述檢測方法制備的血液同型半胱氨酸本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種血液同型半胱氨酸的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）準備工作：將HCY標準品用緩沖液溶解分別配置濃度為50μmol/L、25μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、0？μmol/L的HCY溶液，臨用前15分鐘內配制；將還原劑用緩沖液溶解配制成濃度為1μmol/L還原劑工作液；將HCY特異性轉化酶用緩沖液配制成濃度為0.4？0.6mg/ml的HCY特異性轉化酶工作液；（2）檢測：在96孔板中分別加入HCY？標準品和樣品，加入還原劑工作液還原1h；加入HCY特異性轉化酶工作液反應5min；加入顯色液A,？反應5min；加入顯色液B,？反應10min；（3）標準曲線制備：根據標準品濃度溶液在670nm的吸光度值制備標準曲線，然后計算樣品中HCY含量；或根據標準品濃度溶液在激發波長615nm，發射波長685nm的熒光強度制備標準曲線，計算樣品中HCY含量。
【技術特征摘要】
1.一種血液同型半胱氨酸的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)準備工作將HCY標準品用緩沖液溶解分別配置濃度為50μπιΟ1/1、25μπιΟ1/1、10 μ mol/L,5 μ mol/L,2. 5 μ mol/L,0 μ mol/L的HCY溶液，臨用前15分鐘內配制；將還原劑用緩沖液溶解配制成濃度為I μ mol/L還原劑工作液^fHCY特異性轉化酶用緩沖液配制成濃度為O. 4-0. 6mg/ml的HCY特異性轉化酶工作液； (2)檢測在96孔板中分別加入HCY標準品和樣品，加入還原劑工作液還原Ih;力口入HCY特異性轉化酶工作液反應5min ;加入顯色液A，反應5min ;加入顯色液B，反應IOmin ； (3)標準曲線制備根據標準品濃度溶液在670nm的吸光度值制備標準曲線，然后計算樣品中HCY含量；或根據標準品濃度溶液在激發波長615nm，發射波長685nm的熒光強度制備標準曲線，計算樣品中HCY含量。2.根據權利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述HCY特異性轉化酶為陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸 Y-裂解酶。3.根據權利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述還原劑為二硫蘇糖醇。4.根據權利要求I所述的檢測方...
【專利技術屬性】
技術研發人員：弓景波，錢令嘉，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所，
類型：發明
國別省市：
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