包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法及PSA膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒技術

本發明專利技術涉及包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法及PSA膠乳增強免疫比濁法試劑盒。本發明專利技術通過優化的物理吸附方法將PSA抗體結合至膠乳顆粒后而獲得包被有PSA抗體的膠乳顆粒。本發明專利技術的試劑盒利用結合至膠乳顆粒表面的PSA抗體與人類血液樣本中的PSA發生免疫反應形成濁度，通過濁度的上升程度來檢測前列腺特異性抗原含量。

【技術實現步驟摘要】
本專利技術提供了一種包被有前列腺特異性抗原(PSA)抗體的膠乳顆粒的制備方法，以及一種利用免疫比濁方法測定人血液樣本中PSA含量的試劑盒。本專利技術的制備方法以及檢測試劑盒屬于臨床醫學體外診斷領域。
技術介紹
前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen, PSA)是由前列腺上皮細胞合成分泌至精液中，是精漿的主要成分之一。在上個世紀60年代末，在研究免疫避孕過程中Hare等人發現，在前列腺液及精液中含有一種分子量大約34000的精液特異性蛋白質。1979年從前列腺組織中提取并純化了這種蛋白質。由于這種蛋白質只在前列腺組織中存 在，被命名為前列腺特異性抗原。PSA在血清中主要有兩種存在形式一種是游離型的PSA(f-PSA)，約占血清PSA總濃度的10%_30%。另一種是與α I-抗糜蛋白酶(ACT)結合的PSA (PSA-ACT)和與α 2_巨球蛋白(AMG)結合的PSA (PSA-AMG),約占血清PSA總濃度的70%_90%。在前列腺癌患者的血清中，t-PSA和f-PSA均有升高。PSA具有靶器官特異性，前列腺癌患者血清中PSA濃度明顯升高，所以血清PSA的測定被目前公認為診斷前列腺癌的首選標志物。早期敏感性在40-75%之間，中后期可達75-95%，因此它對前列腺癌的診斷和病程監測具有一定的臨床價值。對于PSA的定量檢測分析，目前包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和化學發光免疫分析(CLIA)。ELISA操作過程復雜，自動化程度低，檢測范圍窄，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性等缺點也不能滿足臨床的要求。RIA必須用125I等放射性元素標記，檢測設備復雜，必須用專門的儀器測定，其放射性核素的半衰期短，不能長期保存，測定結果不穩定，同時也給實驗操作人員帶來了放射性傷害。CLIA雖然提高了檢測的敏感度和自動化程度，但通常需要昂貴的全自動化學發光測量儀，存在檢測時間長和檢測成本聞的缺點。膠乳增強透射免疫比濁檢測(PETIA)技術是在膠乳凝集定性試驗基礎上發展建立的一種非放射性均相免疫測定法，可以對各種微量的抗原物質和小分子半抗原進行精確的定量測定，目前越來越多的應用到臨床實驗室中。與CLIA技術相比，PETIA有效的提高檢測速度和降低檢測成本。然而，PSA的定量檢測分析需要較高的靈敏度，一般的PETIA技術很難達到同CLIA技術相同的靈敏度，需要對PETIA技術的優化改進來達到提高檢測PSA靈敏度的目的。在膠乳增強免疫比濁試劑中，將抗原或抗體與膠乳相結合是制備試劑中最重要的步驟，通常有物理吸附法和化學交聯法。化學交聯法是通過抗原或抗體與膠乳表面的化學基團反應，將抗原或抗體交聯在膠乳上。由于化學交聯法的反應條件較為強烈且反應時間較長，抗原或抗體的活性損失較大。所以，物理吸附法是一種反應更溫和、快速的方法。物理吸附法是靠蛋白質分子結構上的疏水基團與膠乳表面的疏水基團間的相互作用，將抗原或抗體吸附到膠乳表面，由于這是一種弱作用力，蛋白質很容易從顆粒表面解吸下來，導致靈敏度下降且試劑穩定性差。吸附上的抗原(或抗體)量越多、越不易脫落，則靈敏度越高、穩定性越好。由于這種吸附力也會導致一些雜質也吸附到膠乳顆粒上，進一步影響了抗原(或抗體)對顆粒的結合。因此，仍然需要改善包被有抗原(或抗體)的膠乳顆粒的制備方法。
技術實現思路
根據本專利技術的一方面，涉及一種包被有前列腺特異性抗原(PSA)抗體的膠乳顆粒的制備方法，其特征在于，包括步驟I)將膠乳顆粒溶于MES緩沖液中；2)將PSA抗體溶于MES緩沖液中；·3)將步驟2)獲得的混合物立即加入到步驟I)獲得的混合物中進行反應；4)向步驟3)的反應體系中加入甘氨酸緩沖液終止反應；5)離心去掉上清；6)獲得包被有PSA抗體的膠乳顆粒。在本專利技術的優選實施方式中，步驟I)中的MES緩沖液還含有甘油。在本專利技術的一些實施方式中，步驟I)中的MES緩沖液還含有含量為O. 01%至O. 5%的甘油。在一個具體的實施方式中，含有O. 15%的甘油。在本專利技術的一個具體的實施方式中，步驟I)和步驟2)中所述的MES緩沖液為O. 05M MES 緩沖液 pH6。在本專利技術的一些實施方式中，步驟3)所述的反應為在25_40°C下進行1_3小時。在本專利技術的一個具體的實施方式中，步驟3)所述的反應是在37°C下進行2小時。在本專利技術的一個具體的實施方式中，步驟4)所述的甘氨酸緩沖液為O. IM的甘氨酸緩沖液PH7。在本專利技術的一些實施方式中，步驟4)所述的終止反應進行O. 5-2小時。終止反應的反應時間可以由技術人員來確定，可以攪拌或不攪拌，優選在攪拌條件下進行，以保證混合均勻，攪拌速度可以由技術人員根據本領域常規選擇來確定。因此，在本專利技術的一個具體的實施方式中，步驟4)所述的終止反應在攪拌條件下進行I小時。在本專利技術的一些實施方式中，所述膠乳顆粒是聚苯乙烯膠乳顆粒。優選地，所述聚苯乙烯膠乳顆粒表面修飾有選自如下化學基團中的一種硫酸基、磺酸基、羧基、氨基、羥基、酰肼基、氯甲基。在本專利技術的一個具體的實施方式中，所述膠乳顆粒是磺酸基修飾的聚苯乙烯膠乳顆粒。優選地，聚苯乙烯膠乳顆粒直徑范圍為50-250nm。在本專利技術的一些實施方式中，所述PSA抗體為PSA多克隆抗體或PSA單克隆抗體，優選地，所述PSA抗體為PSA單克隆抗體。優選地，所述PSA單克隆抗體可以通過常見文獻報道的方法，包括但不限于雜交瘤技術，而獲得；或者也可以購買商品化的產品，例如Hytest、Fitzgerald等。在本專利技術的一個具體的實施方式中，所述PSA單克隆抗體是通過雜交瘤細胞技術制備的。在本專利技術的一些實施方式中，在步驟5)和步驟6)之間還可以包括用甘氨酸緩沖液洗滌膠乳顆粒的步驟。優選地，所述甘氨酸緩沖液為含有O. 9%氯化鈉、50mM EDTA,O. 5%BSA、0. 5%吐溫20、0. 09%疊氮化鈉的IOOmM甘氨酸緩沖液pH7。根據本專利技術的另一方面，本專利技術還提供一種用于測定人血液樣本PSA含量的膠乳增強免疫比濁法試劑盒，其特征在于，包括Rl試劑和R2試劑；所述Rl試劑包括緩沖液、穩定劑、促凝劑和防腐劑；所述R2試劑包括根據上述制備方法而獲得的包被有PSA抗體的膠乳顆粒、緩沖液、穩定劑和防腐劑。在本專利技術的優選實施方式中，試劑盒還可以包括校準品。優選地，校準品由PSAJ^沖液、穩定劑和防腐劑組成。在本專利技術的一些實施方式中，膠乳顆粒是聚苯乙烯膠乳顆粒。優選地，所述聚苯乙烯膠乳顆粒表面修飾有選自如下化學基團中的一種硫酸基、磺酸基、羧基、氨基、羥基、酰肼基、氯甲基。在本專利技術的一些實施方式中，膠乳顆粒直徑范圍為50_250nm，濃度為O. 05-0. 5%。在本專利技術的一個具體實施方式中，膠乳顆粒直徑為lOOnm，最終R2試劑中PSA單克隆抗體包·被的聚苯乙烯膠乳顆粒濃度為O. 25%。在本專利技術的一些實施方式中，所述PSA抗體為PSA多克隆抗體或PSA單克隆抗體。在本專利技術的一個優選的實施方式中，所述PSA抗體為PSA單克隆抗體。優選地，所述PSA單克隆抗體可以通過常見文獻報道的方法而獲得；或者也可以購買商品化的產品，例如Hytest、Fitzgerald等。在本專利技術的一個具體的實施方式中,所述PSA單克隆抗體本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其特征在于，包括步驟：1）將膠乳顆粒溶于MES緩沖液中；2）將前列腺特異性抗原抗體溶于MES緩沖液中；3）將步驟2）獲得的混合物立即加入到步驟1）獲得的混合物中進行反應；4）向步驟3）的反應體系中加入甘氨酸緩沖液終止反應；5）離心去掉上清；6）獲得包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒。

【技術特征摘要】
1.一種包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其特征在于，包括步驟 1)將膠乳顆粒溶于MES緩沖液中； 2)將前列腺特異性抗原抗體溶于MES緩沖液中； 3)將步驟2)獲得的混合物立即加入到步驟I)獲得的混合物中進行反應； 4)向步驟3)的反應體系中加入甘氨酸緩沖液終止反應； 5)離心去掉上清； 6)獲得包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒。2.根據權利要求I所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中步驟I)中所述的MES緩沖液還含有甘油。3.根據權利要求2所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中甘油含量為O. 01%至O. 5%。4.根據權利要求3所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中甘油含量為O. 15%。5.根據權利要求I所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中步驟I)和步驟2)中所述的MES緩沖液為O. 05MMES緩沖液pH6。6.根據權利要求I所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中步驟3)所述的反應為在25-40°C下進行1-3小時。7.根據權利要求6所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中步驟3)所述的反應為在37°C進行2小時。8.根據權利要求I所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中步驟4)所述的甘氨酸緩沖液為O. IM甘氨酸緩沖液pH7。9.根據權利要求I所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中步驟4)所述的終止反應進行O. 5-2小時。10.根據權利要求9所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中步驟4)所述的終止反應在攪拌條件下進行I小時。11.根據權利要求I所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中所述膠乳顆粒是聚苯乙烯膠乳顆粒。12.根據權利要求11所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中所述聚苯乙烯膠乳顆粒表面修飾有選自如下化學基團中的一種硫酸基、磺酸基、羧基、氨基、羥基、酰肼基和氯甲基。13.根據權利要求11所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中所述聚苯乙烯膠乳顆粒直徑范圍為50-250nm。14.根據權利要求I所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中所述前列腺特異性抗原抗體為前列腺特異性抗原多克隆抗體或前列腺特異性抗原單克隆抗體。15.根據權利要求14所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中所述前列腺特異性抗原抗體為前列腺特異性抗原單克隆抗體。16.根據權利要求I所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中在步驟5)和步驟6)之間還包括用甘氨酸緩沖液洗滌膠乳顆粒的步驟。17.根據權利要求16所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中所述甘氨酸緩沖液為含有氯化鈉、EDTA, BSA、吐溫和疊氮化鈉的IOOmM甘氨酸緩沖液pH7。18.根據權利要求17所述的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒的制備方法，其中所述甘氨酸緩沖液為含有O. 9%氯化鈉、50mM EDTA、0. 5%BSA、0. 5%吐溫20和O. 09%疊氮化鈉的IOOmM甘氨酸緩沖液pH7。19.一種測定人血液樣本前列腺特異性抗原含量的膠乳增強免疫比濁法試劑盒，其特征在于，包括Rl試劑和R2試劑； 所述Rl試劑包括緩沖液、穩定劑、促凝劑和防腐劑； 所述R2試劑包括根據權利要求I至18任一項所述的制備方法而獲得的包被有前列腺特異性抗原抗體的膠乳顆粒...

【專利技術屬性】
技術研發人員：高愛民，孫國敬，張小銳，徐麗，劉希，
申請(專利權)人：北京九強生物技術股份有限公司，
類型：發明
國別省市：