一種人原代腫瘤細胞分離與培養試劑盒制造技術

本實用新型專利技術提供一種人原代腫瘤細胞分離與培養試劑盒，由由包裝盒(1)、6孔細胞培養板（2）、清洗液瓶（3）、胰酶消化液瓶(4)、膠原酶－透明質酸酶消化液瓶(5)、細胞分離液瓶(6)、腫瘤選擇性培養液瓶(7)、使用說明書(8)組成。其中清洗液是含青霉素400U/mL、鏈霉素400ug/mL的無菌RPMI1640細胞培養液。本實用新型專利技術克服當前原代腫瘤細胞培養過程復雜、所得腫瘤純度不高、易受細胞污染的問題。本實用新型專利技術設計合理，在進行體外原代腫瘤細胞的分離與培養過程中受細菌污染的機會少，僅需要少量離心管等其它常用耗材，因此使用簡單方便，培養的腫瘤細胞純度更高、效果好。（*該技術在2021年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本技術屬生物
，涉及一種人原代腫瘤細胞分離與培養試劑盒。
技術介紹
腫瘤細胞培養是研究癌變機理和腫瘤細胞生物學特征的重要手段，應用體外培養技術進行腫瘤研究具有許多優點(I)可免受機體內部因素的影響，從而便于探索物理、化學和生物等各種因素對腫瘤細胞生命活動的影響；(2)便于研究腫瘤細胞的結構和功能；可長期保存以便觀察腫瘤細胞遺傳行為的改變；(4)可用于快速篩選抗癌藥物。腫瘤細胞培養技術分為原代腫瘤細胞培養和腫瘤細胞株培養。原代腫瘤細胞培養指直接從活體腫瘤標本中分離腫瘤細胞后培養在體外環境中；腫瘤細胞株培養指將活體腫·瘤標本來源的腫瘤細胞體外培養，不斷純化，形成生物性狀和遺傳基本一致的細胞株，隨著腫瘤不斷傳代，其細胞株的生物學特征和遺傳性狀與原代腫瘤細胞相比可能也會發生一定的變化，因此原代腫瘤細胞培養是許多腫瘤學研究(如個體腫瘤藥敏試驗、個體化的腫瘤抗原誘導的腫瘤生物治療、腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞實驗等)的關鍵技術之一。近年來研究證實，樹突狀細胞(DC)被各種形式的腫瘤抗原致敏后可以在體內外誘導出腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，目前利用DC進行腫瘤免疫治療已進入臨床試驗階段。GM-CSF與IL-4聯合應用可誘導單核細胞成為具有未成熟表型的DC，再予一定的刺激信號作用，如TNF-α、LPS等細胞因子，可誘導出成熟DC，使其抗原呈遞功能達到最佳狀態。在體外細胞培養和裸鼠腫瘤動物模型的腫瘤殺傷試驗中，腫瘤抗原負載的DC-CIK(樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞)療法在T細胞激活、誘導腫瘤細胞凋亡等方面較其它生物治療方式如LAK (淋巴因子激活的殺傷細胞)治療等表現出明顯的優勢，但在臨床應用研究中也發現，DC-CIK療法并未獲得如體外培養和動物模型中一般的治療效果，究其原因，可能與DC低表達MHCI類分子有關，而MHCI類分子正是遞呈腫瘤抗原的必要分子，也可能與目前原代腫瘤細胞分離與培養技術有關。實體腫瘤組織中除含有腫瘤細胞以外,還包括大量的紅細胞、單核細胞、淋巴細胞、內皮細胞、成纖維細胞等細胞成分,腫瘤組織經膠原酶等消化液消化分離后，上述細胞與腫瘤細胞一起被分離，混合培養后，即使經過腫瘤細胞的選擇性培養基篩選，所獲得的腫瘤細胞純度也約在60% 70%，仍然可能影響腫瘤特異性激活CTL的能力。在原代腫瘤細胞分離與培養過程中，細菌污染也是一個影響培養成功率的嚴重問題，腫瘤標本多來自于手術切除的大體標本，在剪切腫瘤標本及轉移至實驗室的過程中都有可能受到細胞污染，尤其是胃腸道腫瘤，標本本身即可能帶有大量胃腸道細胞，因此原代腫瘤細胞培養過程中需要極其細胞預防細胞污染的問題。當前的原代腫瘤細胞培養方法仍采用的是傳統的原代細胞培養方法，主要過程包括(I)清洗標本并將腫瘤標本剪碎成約Imm3大小；(2)將剪碎的腫瘤標本用胰酶或膠原酶消化；(3)收集消化下來的細胞，用密度梯度離心法等各種方法加以純化后在腫瘤細胞專用培養基中培養。在上述過程中需要用到多種的耗材和試劑，包括細胞培養皿或培養板、消化酶、清洗液、分離液、選擇隆培養液等等，很容易出現細胞污染的問題。因此有必要開發專門的各種腫瘤原代培養的試劑盒。
技術實現思路
本技術提供一種人原代腫瘤細胞分離與培養試劑盒，由包裝盒、6孔細胞培養板、清洗液、胰酶消化液、膠原酶一透明質酸酶消化液、細胞分離液、腫瘤選擇性培養液、使用說明書組成。其中清洗液是含青霉素400U/mL、鏈霉素400ug/mL的無菌RPMI 1640細胞培養液，分裝入2支5ml無菌密封瓶，貼上標簽，4°C保存。胰酶消化液是用無菌超純水配制含O. 1%胰蛋白酶(購自Sigma公司，IOOmg)、10g/L聚乙烯吡咯烷酮的胰酶消化液，分裝入5ml無菌密封瓶，貼上標簽，4°C保存。膠原酶一透明質酸酶消化液是用RPMI 1640細胞培養液配制膠原酶一透明質酸酶消化液，其中膠原酶(購自Sigma公司，IOOmg)終濃度為2g/L,透明質酸酶(購自Sigma·公司，IOOmg)終濃度為2g/L，分裝入5ml無菌密封瓶，貼上標簽，4°C保存。細胞分離液是將純percoll分離液(購自Pharmacia, IOOml)與10倍PBS緩沖液以體積比為9:1比例混合后再與I倍PBS液以體積比為7:3比例混勻后制備密度為I. 09的細胞分離液，分裝入5ml無菌棕色密封瓶，貼上標簽，4°C避光保存。腫瘤選擇性培養液是在RPMI 1640細胞培養液基礎上添加10%新生胎牛血清、青霉素100U/mL、鏈霉素100ug/mL、胰島素5ug/mL、氫化可的松2ug/mL、人重組表皮生長因子5ng/mL (購自Invitrogen公司，IOOug),分裝入5ml無菌密封瓶,貼上標簽,4°C保存。本技術的有益效果使用本技術可以更簡便地實施體外原代腫瘤細胞的分離與培養，培養的腫瘤細胞純度更高，受細胞污染的機會更少。本技術的主要技術原理是采用胰酶消化液和膠原酶、透明質酸酶消化液遞次消化提高消化效果；70%percoll分離液去除紅細胞；鼠尾膠原與鼠抗人THY-I抗體混合包被腫瘤選擇培養孔；用腫瘤選擇性培養基擴增培養腫瘤細胞，從而獲得純度極高的原代腫瘤細胞，分離與培養過程中受細菌污染的機會少，僅需要少量離心管等其它常用耗材，因此具有簡單方便和培養效果好的優點。為了克服當前原代腫瘤細胞培養過程復雜、所得腫瘤純度不高、易受細胞污染的問題，簡單方便。附圖說明圖I是本技術的結構示意圖。圖2是本技術6孔細胞培養板編號示意圖。具體實施方式本技術結合附圖和實施例作進一步的說明。實施例一參見圖I、圖2，試劑盒由包裝盒1、1塊6孔細胞培養板2、5ml清洗液3、1瓶5ml胰酶消化液4、I瓶5ml膠原酶一透明質酸酶消化液5、I瓶5ml細胞分離液6、I瓶5ml腫瘤選擇性培養液7、使用說明書8組成。其中清洗液3是含青霉素400U/mL、含鏈霉素400ug/mL的無菌RPMI 1640細胞培養液，裝入2個5ml無菌密封瓶，貼上標簽，4°C保存。胰酶消化液4是用無菌超純水配制含O. 1%胰蛋白酶(購自Sigma公司，IOOmg)、10g/L聚乙烯吡咯烷酮的胰酶消化液，分裝入5ml無菌密封瓶，貼上標簽，4°C保存。膠原酶一透明質酸酶消化液5是用RPMI 1640細胞培養液配制膠原酶一透明質酸酶消化液，其中膠原酶(購自Sigma公司，IOOmg)終濃度為2g/L,透明質酸酶(購自Sigma公司，IOOmg)終濃度為2g/L，分裝入5ml無菌密封瓶，貼上標簽，4°C保存。細胞分離液6是將純percoll分離液(購自Pharmacia, 100ml)與10倍PBS緩沖液以體積比為9:1比例混合后再與I倍PBS液以體積比為7:3比例混勻后制備密度為I. 09的細胞分離液，分裝入5ml無菌棕色密封瓶，貼上標簽，4°C避光保存。腫瘤選擇性培養液7是在RPMI 1640細胞培養液基礎上添加10%新生胎牛血清、青霉素100U/mL、鏈霉素100ug/mL、胰島素5ug/mL、氫化可的松2ug/mL、人重組表皮生長因子5ng/mL (購自Invitrogen公司，IOOug),分裝入5ml無菌密封瓶,貼上標簽,4 保存。·6孔細胞培養板2可采購市場本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人原代腫瘤細胞分離與培養試劑盒，其特征在于，由包裝盒(1)、6孔細胞培養板（2）、清洗液瓶（3）、胰酶消化液瓶(4)、膠原酶－透明質酸酶消化液瓶(5)、細胞分離液瓶(6)、腫瘤選擇性培養液瓶(7)、使用說明書(8)組成。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：丁國平，曹利平，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：實用新型
國別省市：