一種減弱反饋抑制菌株生產谷胱甘肽的方法技術

本發明專利技術提供了一種谷胱甘肽合成酶系重組質粒及其構建方法和應用、一種谷胱甘肽合成酶系的重組質粒及其構建方法和應用、一種累積谷胱甘肽方法。本發明專利技術提供的谷胱甘肽合成酶系重組質粒包括GSH1和GSH2序列和兩段合適的載體片段；這種方法的原理在于，GSH1與GSH2連接在啟動子不同的載體上，通過在不同時間添加誘導劑實現GSH1與GSH2的分步表達而減少反饋抑制；使用本發明專利技術提供的方法可以明顯的減弱反饋抑制，提高了谷胱甘肽生產量，提高原料利用率，可為進一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一個基礎模型。除此之外，該方法及思路可以用于其他因反饋抑制限制產量提高的目的產物，為生產有價值的產品提供了新的思路。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物工程
，具體地說，是關于一株用減弱了反饋抑制的菌株提高谷胱甘肽累積量的方法。
技術介紹
谷胱甘肽(Y-L-glutamyl-cysteiny 1-glycine, GSH),是由 L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成的生物活性三肽化合物，是細胞內重要的抗氧化劑和主要的非蛋白巰基化合物(> 90% )。在生物組織中，谷胱甘肽通過谷胱甘肽還原酶保持氧化型和還原型的動態平衡并發揮細胞保護、物質代謝、信息調控、調節細胞及組織的發育、對抗或誘發疾病等作用，因此，大量應用于醫藥保健、護膚美容、食品添加等行業。對于谷胱甘肽的生產，經歷了萃取法、化學合成法、酶催化法和發酵法，其中發酵法已成為生產谷胱甘肽的主要方法。基于發酵法的菌株選育和條件優化等生產方法的應用也使谷胱甘肽的生產得到了提高并廣 泛在實驗室規模上加以實驗，但應用于實踐的卻不多，究其原因，主要是谷胱甘肽合成過程中的限速酶，Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶容易受到終產物谷胱甘肽的反饋抑制，當終產物濃度達到一定程度后就會反饋抑制Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性，使產量維持在較低的水平。多年來，科研工作者們用了很多方法試圖通過減弱反饋抑制的方法來提高目的產物的產量，如Murata等人早期成功構建了具有較強GSH合成能力的重組E. coli并從E. coliB中篩選得到一株GSHl脫敏突變株，克隆了其GSHl基因并在E. coli B RC912中得以表達，獲得的菌株合成GSH的能力大大提高。Liang與Zhao等人通過在培養基中添加表面活性劑和制霉素的方法抑制細胞膜的合成，使產物及時的分泌出來，減弱了反饋抑制，提高了產量。但這些操作都是基于提高酶系的活力或降低酶系對GSH的敏感性，沒從本質上消除反饋抑制。況且，一些表面活性劑的加入會對細胞產生一定的毒性。因此，尋求新的方法減弱或者消除反饋抑制以從根本上提高目的產物的產量顯得尤為重要。
技術實現思路
本專利技術的目的在于，提供一種谷胱甘肽合成酶系重組質粒，以用于構建表達谷胱甘肽合成酶系的菌株。本專利技術還有一個目的在于，提供一種谷胱甘肽合成酶系重組質粒的構建方法。本專利技術還有一個目的在于，提供一種谷胱甘肽合成酶系重組質粒的應用。本專利技術還有一個目的在于，提供。本專利技術提供的谷胱甘肽合成酶系重組質粒包括GSHl和GSH2序列和兩個合適的載體片段；所述GSHl和GSH2序列分別如NCBI上Gene ID為242378250和253978924的序列所示。根據本專利技術的一個優選實施例，在谷胱甘肽合成酶系重組質粒中，GSHl和GSH2分別連接在不同的載體上，根據兩個載體啟動子的不同調控兩個基因表達的時間，從而使GSHl和GSH2分開表達，進而使合成Y-谷氨酰半胱氨酸(谷胱甘肽合成過程中的中間產物，由Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶催化合成)和谷胱甘肽分步進行，消除反饋抑制。根據本專利技術的另一個優選實施例，所述谷胱甘肽合成酶系重組質粒分別包括一個卡那霉素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因，用以篩選基因重組菌。本專利技術提供的谷胱甘肽合成酶系重組質粒的構建方法包括以下步驟A) PCR擴增獲得GSHl和GSH2序列；B)將GSHl和GSH2序列分別克隆入pET28a和pBAD24。本專利技術提供的谷胱甘肽合成酶系重組質粒可用于構建表達谷胱甘肽合成酶系的菌株。 本專利技術提供的方法可用于累積谷胱甘肽。本專利技術提供的累積谷胱甘肽的方法通過發酵培養本專利技術提供的谷胱甘肽合成酶系重組菌株，累積谷胱甘肽。根據本專利技術的另一個優選實施例，累積谷胱甘肽的方法還通過，在選擇高產菌株后，通過高密度發酵的技術來累積谷胱甘肽。使用本專利技術提供的雙質粒可以構建累積谷胱甘肽大腸桿菌，可以明顯的減弱反饋抑制，提高了谷胱甘肽生產量，提高了原料利用率、降低了成本和能耗，可為進一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一個基礎模型。除此之外，該方法構建的菌株及思路可以用于其他因反饋抑制限制產量提高的目的產物，為生產有價值的產品提供了新的思路。附圖說明圖I是PCR擴增獲得的GSHl的檢測結果，其中泳道I為GSHl。圖2是PCR擴增獲得的GSH2的檢測結果，其中泳道I為GSH2。圖3是BL21-GSH1，BL21-GSH2及BL21-GSH12質粒PCR后的電泳圖，其中泳道1，2，3和4，5，6分別對應GSH1GSH2及GSHl和GSH2的DNA片段。具體實施例方式以下結合具體實施例，對本專利技術作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本專利技術而非用于限定本專利技術的范圍。以下實施例中為注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗室手冊》(New York CoLd Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或廠商提供的方案進行。在本專利技術的下述實施例中，使用的膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒均購自生工生物公司。在本專利技術的下述實施例中，使用的pMD-18TSimpLe Vector,Hind III,Xba I,BamHI, Taq DNA聚合酶，T4DNA連接酶，DNA Marker,均購自TAKARA公司。在本專利技術的下述實施例中，使用的表達載體pET28a、pBAD24,菌種E. coliBL21(DE3)、E. coli DH5 α，為中國藥科大學生命中心實驗室保存，其中菌種E. coliBL21 (DE3)的 ATCC 編號為 BAA-1025 。在本專利技術的下述實施例中，使用的E. coli BL21(DE3)感受態細胞、E. coli DH5 α感受態細胞，購自天根生化科技有限公司。在本專利技術的下述實施例中，使用的LB培養基的配方為1%胰蛋白棟，O. 5%酵母浸粉，1% NaCl ;使用的搖瓶發酵培養基的配方為1%胰蛋白棟，O. 5%酵母浸粉，l%NaCl。配置固體LB平板培養基時，按照上述配方添加2%瓊脂粉。在本專利技術的下述實施例中，感受態細胞的制備和轉化，按照《分子克隆實驗室手冊》提供的方法進行。實施例I兩個表汰質粒的構律I. I引物設計根據NCBI報道的GSHl和GSH2序列，設計以下4條引物 GSHlUP CGCGGATCCATGATCCCGGACGTATCACAGGC ；GSHlDOffN CCCAAGCTTTCAGGCGTGTTTTTCCAGCCACACC ；GSH2UP GCTCTAGAGATGATCAAGCTCGGCATCGT ；GSH2D0WN :ATGAAGCTTTTACTGCTGCTGTAAACGTGC。其中GSHlUP和GSH1D0WN用于擴增GSHl編碼區；GSH2UP和GSH2D0WN用于擴增GSH 編碼區；GSH1UP、GSH1D0WN、GSH2UP、GSH2D0WN 上的下劃線表示在 GSH1UP、GSH1D0WN、GSH2UP、GSH2D0WN 上分別引入的 BamH I, Hind III、XbaI 和 Hind III 酶切位點。I. 2PCR 擴增 GSHl 和 GSH2 序列抽提得到大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)基因組。以大腸桿菌E. coli BL21(DE3)基因組為模板，分別以步驟I. I中設計的GSHlUP和GSH1D0WN以及GSH2UP和GSH2D0WN為引物本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種谷胱甘肽合成酶系重組質粒，其特征在于，重組質粒包括兩個，分別由GSH1和GSH2序列和一段合適的載體片段連接而成，所述GSH1和GSH2序列分別如NCBI上Gene？ID為242378250和253978924的序列所示，載體片段為pET28a和pBAD24。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：許激揚，卞筱泓，趙玉成，邵飛，
申請(專利權)人：中國藥科大學，
類型：發明
國別省市：