本發(fā)明專利技術(shù)是一種用于抑制基因表達的微核糖核酸載體構(gòu)建方法，該方法首先利用設(shè)計好的反向互補的雙鏈DNA序列的作為模板，經(jīng)過退火處理后，將退火的雙鏈模板通過T4連接酶連接到質(zhì)粒載體上，然后再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌DH5α中，通過抗性篩選、酶切鑒定、測序鑒定等獲得我們所要表達的miRNA。與現(xiàn)有的其他技術(shù)相比，該系統(tǒng)能在各種培養(yǎng)的細胞中有效、持久地表達miRNA，無任何致病作用。本發(fā)明專利技術(shù)的方法不僅所需設(shè)備簡單、操作便利，適合各種不同種類的miRNA的表達，而且易于對所需miRNA進行大量的制備，不僅可用于體外實驗，實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。而且可望用于種癌癥、心血管疾病等的新型生物制劑進行開發(fā)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及的是一種利用在一段基因片段中構(gòu)建反向互補重復(fù)的雙鏈DNA序列插入到質(zhì)粒載體里，從而高效表達microRNA (miRNA)的方法，屬于基因工程和生物制品研究領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
miRNA作為21世紀(jì)生命科學(xué)研究最為重大的發(fā)現(xiàn)之一，因其在基因表達調(diào)控過程中的重要性，已在短時間內(nèi)成為了世界科學(xué)家研究的焦點，并迅速取得了令人矚目的進展。這類長度只有 22nt的非編碼RNA基因產(chǎn)物，它調(diào)節(jié)生物體內(nèi)三分之一的信使RNA(mRNA)的表達。并參與細胞分化、增殖、凋亡、胰島素分泌以及心臟、大腦、骨骼肌發(fā)育以及疾病發(fā)生等一系列的生命過程。據(jù)研究人員稱，miRNA參與人體內(nèi)包括腫瘤發(fā)生在內(nèi)的多種生物 學(xué)過程。在臨床研究中對患者進行miRNA水平的檢測有可能具有診斷學(xué)價值。已有證據(jù)表明，與正常組織相比，腫瘤組織內(nèi)大部分miRNA的表達上升。這些研究結(jié)果表明，miRNA有望成為鑒別正常組織和腫瘤組織的biomarker。在腫瘤發(fā)生過程中進行miRNA表達譜的鑒定有利于發(fā)現(xiàn)基因治療的新靶點，并提高疾病診斷和預(yù)后的正確性。已有的研究表明，miRNA與各種疾病相關(guān)，如癌癥和一些由病毒感染引發(fā)的疾病，這就為各種疾病治療提供了新的潛在靶標(biāo)。一直以來人們都在嘗試研究如何在體內(nèi)特異地調(diào)節(jié)miRNA的水平。幸運的是，這么多年來在反義RNA、核酶以及一些基因治療方法上取得的研究成果為體內(nèi)研究miRNA提供了一個良好的技術(shù)平臺。早期的研究表明2-0-甲基化寡聚核苷酸可以抑制miRNA在培養(yǎng)細胞和果蠅中的功能,一些報道表示anti-miR結(jié)合到RISC的成熟miRNA的guide strand上會發(fā)生miRNA介導(dǎo)的anti-miR干擾。有趣的是,拮抗這種結(jié)合同時會導(dǎo)致祀miRNA的降解。通過設(shè)計與miRNA guide strand互補的反義寡聚核苷酸可以抑制培養(yǎng)的細胞、果蠅以及小鼠中某些miRNA的功能。同時，我們還可以設(shè)計表達某些特異性miRNA的載體導(dǎo)入到體內(nèi)，來提高體內(nèi)某些miRNA的表達水平。這些被稱為“anti-miR”或“antago-miR”的抑制劑和miR-mimics有望用于臨床研究。目前anti-miR或者antago-miR在體內(nèi)應(yīng)用的最大困難還在于如何系統(tǒng)或局部地遞送這些分子。現(xiàn)今最常用的基因遞送系統(tǒng)包括病毒載體和非病毒載體。病毒載體由于可能與宿主基因組發(fā)生重組在實際應(yīng)用中受到很大的限制，而非病毒載體由于具無傳染性、不限制載體容量；可大量制備等優(yōu)點而受到許多研究人員和臨床醫(yī)生的青睞。由于可以進行不同形式的修飾，方便其到達特異的組織部位，實現(xiàn)基因的靶向遞送，非病毒類載體一直是基因治療的研究熱點。為此，本申請通過利用在一段基因片段中構(gòu)建反向互補的雙鏈DNA序列插入到質(zhì)粒載體里，從而高效表達miRNA的方法，實現(xiàn)抑制基因的表達。可用于癌癥、心血管疾病等的治療。
技術(shù)實現(xiàn)思路
技術(shù)問題本專利技術(shù)的目的是提供一種構(gòu)建高效表達miRNA的非病毒載體的方法，該方法易于對miRNA載體進行大規(guī)模的制備，可用于基因的表達調(diào)控，從而實現(xiàn)對疾病如癌癥、心血管疾病、冠心病等的干預(yù)和治療。技術(shù)方案本專利技術(shù)用于抑制基因表達的微核糖核酸載體構(gòu)建方法，利用在一段基因片段里設(shè)計并構(gòu)建反向互補的雙鏈DNA序列插入到質(zhì)粒載體里，從而高效表達miRNA，具體包括以下步驟a.設(shè)計微核糖核酸miRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，并采用固相亞磷酰胺三酯法合成該結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸序列；b.將合成的單鏈寡核苷酸序列退火處理，并且以此作為模板，用于下游的連接反應(yīng)；c.將退火處理過的模板用T4連接酶連接插入到質(zhì)粒載體上，然后將載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中；接種到含有抗生素的LB肉湯培養(yǎng)基中篩選； d.挑取但菌落，酶切、測序鑒定。e.將測序正確的載體轉(zhuǎn)染到細胞中，檢測其表達。所合成的單鏈寡核苷酸序列經(jīng)過事先精心設(shè)計；設(shè)計的原則是針對選定要表達的miRNA，根據(jù)堿基配對原理和選擇的酶切位點使正、反義鏈同時表達所需的miRNA。連接插入到質(zhì)粒載體上的模板是經(jīng)過退火的、反向互補的雙鏈寡核苷酸序列。有益效果本專利技術(shù)利用利用在一段基因片段中設(shè)計并構(gòu)建反向互補的雙鏈DNA序列插入到質(zhì)粒載體里，從而高效表達miRNA的方法，用于抑制基因的表達；具有如下的優(yōu)點第一本專利技術(shù)的方法所需設(shè)備簡單、操作便利，第二本專利技術(shù)的方法適合于構(gòu)建不同種類的miRNA，第三本專利技術(shù)的方法也適合于構(gòu)建和miRNA完全互補的反義序列，第四本專利技術(shù)易于對miRNA進行大規(guī)模的制備，可用于調(diào)控基因的表達，從而有望用于疾病的治療等。附圖說明圖I是本專利技術(shù)原理示意圖，其中有要表達的miRNA序列1，環(huán)2，側(cè)翼序列3，載體4。具體實施例方式本專利技術(shù)利用在一段基因片段里設(shè)計并構(gòu)建反向互補的雙鏈DNA序列插入到質(zhì)粒載體里，從而高效表達miRNA的方法。包括以下步驟a.設(shè)計miRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，并采用固相亞磷酰胺三酯法合成該結(jié)構(gòu)的單鏈脫氧核糖核酸序列；b.將化學(xué)合成的單鏈脫氧核糖核酸退火處理，并以此作為模板，用于下游的連接反應(yīng);c.將退火處理過的模板用T4連接酶連接到質(zhì)粒載體上，然后將載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中；接種到含有抗生素的LB (Luria-Bertani)肉湯培養(yǎng)基中篩選；d.挑取但菌落，酶切、測序鑒定。下面結(jié)合實例對本專利技術(shù)做進一步的說明(I)設(shè)計要表達的miRNA的頸環(huán)結(jié)構(gòu)(實驗示意圖見圖I),并采用固相亞磷酰胺三酯法合成該結(jié)構(gòu)的單鏈脫氧核糖核酸序列；(2)將化學(xué)合成的兩條單鏈脫氧核糖核酸分別用TE (PH=8. O)緩沖液溶解，取相應(yīng)的正義鏈和反義鏈寡核苷酸溶液各5ul，加入裝有2ul IOX的退火緩沖液的PCR管里，用去離子水補至20ul，在PCR儀上按照如下程序進行退火處理95° C 5min;85° C5min;75° C 5min;70° C 5min;4° C保存。退火處理后得到濃度為10 μ M的模板。將所得模板溶液稀釋至終濃度為20ηΜ，用于連接反應(yīng)。(3)將退火處理過的模板用Τ4連接酶按如下體系連接到質(zhì)粒載體上，權(quán)利要求1.，其特征在于該方法包括以下步驟 a.設(shè)計微核糖核酸miRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，并采用固相亞磷酰胺三酯法合成該結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸序列； b.將合成的單鏈寡核苷酸序列退火處理，并且以此作為模板，用于下游的連接反應(yīng)； c.將退火處理過的模板用T4連接酶連接插入到質(zhì)粒載體上，然后將載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中；接種到含有抗生素的LB肉湯培養(yǎng)基中篩選； d.挑取但菌落，酶切、測序鑒定。e.將測序正確的載體轉(zhuǎn)染到細胞中，檢測其表達。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于抑制基因表達的微核糖核酸載體構(gòu)建方法，其特征在于所合成的單鏈寡核苷酸序列經(jīng)過事先精心設(shè)計；設(shè)計的原則是針對選定要表達的miRNA，根據(jù)堿基配對原理和選擇的酶切位點使正、反義鏈同時表達所需的miRNA。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于抑制基因表達的微核糖核酸載體構(gòu)建方法，其特征在于連接插入到質(zhì)粒載體上的模板是經(jīng)過退火的、反向互補的雙鏈寡核苷酸序列。全文摘要本專利技術(shù)是，該方法首先利用設(shè)計好的反向互補的雙鏈DNA序列的作為模板，經(jīng)過退火處理后，將退火的雙鏈模板通過T4連接酶連接到質(zhì)粒載體上，然后再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌DH5α中，通過抗性篩選、酶切鑒定本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種用于抑制基因表達的微核糖核酸載體構(gòu)建方法，其特征在于該方法包括以下步驟：a.設(shè)計微核糖核酸miRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，并采用固相亞磷酰胺三酯法合成該結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸序列；b.將合成的單鏈寡核苷酸序列退火處理，并且以此作為模板，用于下游的連接反應(yīng)；c.將退火處理過的模板用T4連接酶連接插入到質(zhì)粒載體上，然后將載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中；接種到含有抗生素的LB肉湯培養(yǎng)基中篩選；d.挑取但菌落，酶切、測序鑒定。e.將測序正確的載體轉(zhuǎn)染到細胞中，檢測其表達。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：肖忠黨，梁高峰，劉永平，陳姍姍，陳玲，
申請(專利權(quán))人：東南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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