本發明專利技術公開了一種編碼重組人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其應用。本發明專利技術通過密碼子優化篩選，得到如SEQ?ID?NO.1所示的編碼重組人TNFR-Fc融合蛋白的基因。該基因在CHO細胞中表達量高，且表達出來的蛋白與TNFR的親和力高。將該基因轉入CHO細胞，得到表達重組人TNFR-Fc融合蛋白的細胞。本發明專利技術使用一次性反應器發酵轉有該基因的CHO細胞，操作簡單，得到的蛋白量較使用傳統發酵罐高；特別是在添加補料培養基后，可延長細胞生長時間，提高表達水平，降低生產成本，獲得高純度的目的蛋白。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種蛋白，特別涉及一種編碼重組人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其應用。
技術介紹
人腫瘤壞死因子(TNF-α )是一種活化的單核/巨噬細胞產生的細胞因子,并具有多種生物學效應。TNF-a能夠誘導腫瘤細胞壞死或凋亡，且同時是介導炎癥反應的主要細胞因子。研究發現，TNF-a在類風濕關節炎病人的血清中的含量遠超過正常人的水平，而其可能的致病機理也被慢慢發現。在關節腔中的TNF含量升高，會產生兩方面的作用一方面TNF-a與關節滑膜細胞的受體結合，造成該細胞直接損傷，另一方面，TNF-a可以召集免疫效應細胞聚集至此，分泌更多的細胞因子，產生更強更持久的自身免疫反應。這兩方面共同作用，從而造成了類風濕關節炎患者關節部位腫脹和疼痛?！ぜ毎砻娲嬖趦煞N不同的TNFR，即分子量分別為55KD的TNFRI (CD120a)和75KD的TNFRII(CD120b)。人TNF- α與TNFR的親和力較高，與TNFRI和TNFRII的親和常數分別為I. 23±0. 23ηΜ和O. 36±0. 13ηΜ。這兩種TNFR的膜外區均可脫落，仍然保留結合TNF-α的活性。將受體的膜外區與抗體的Fe段連接，形成的融合蛋白則既可與TNF-α結合，又增加了穩定性，而且通過Fe段可形成二聚體，比天然出現的單體受體對TNF-α有更大的親和力。重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(TNFR-Fc)是一種由美國FDA批準的，可用于治療如類風濕性關節炎等自身免疫疾病的蛋白藥物。Etanercept (EnbrelTM)是已經上市的商品化的TNFR/Fc融合蛋白，也是抗TNF最有效的藥物之一，而生物技術藥物中銷售額最高的產品正是Amgen公司生產的Enbrel。國內中國中信國建所生產的TNFR-Fc融合蛋白已經獲批生產上市，商品名為益賽普，用于治療類風濕性關節炎、強直性脊柱炎的骨和關節損傷。但是，價格仍相對高昂，因此仍需獲得成本較低的生產方法。
技術實現思路
本專利技術的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種編碼重組人TNFR-Fc融合蛋白的基因。本專利技術的另一目的在于提供所述的編碼重組人TNFR-Fc融合蛋白基因的應用。本專利技術的目的通過下述技術方案實現一種編碼重組人TNFR-Fc融合蛋白的基因，核苷酸序列如下所示ATGGCCCCCGTGGCCGTGTGGGCTGCCCTGGCCGTGGGACTGGAACTGTGGGCTGCTGCCCACGCCCTGCCCGCCCAGGTGGCCTTCACCCCCTACGCCCCCGAGCCAGGCAGCACCTGCAGGCTGAGAGAGTACTACGACCAGACCGCCCAGATGTGCTGCAGCAAGTGCTCTCCAGGCCAGCATGCCAAGGTGTTCTGCACCAAGACCAGCGACACCGTGTGCGACAGCTGCGAGGACAGCACCTACACCCAGCTGTGGAACTGGGTGCCCGAGTGCCTGAGCTGTGGCAGCAGGTGCTCTAGCGACCAGGTCGAGACCCAGGCCTGCACCAGAGAGCAGAACAGGATCTGCACCTGCAGACCCGGCTGGTACTGCGCCCTGAGCAAGCAGGAAGGCTGCAGGCTCTGCGCCCCACTGAGGAAGTGCAGGCCCGGCTTCGGCGTGGCCAGACCCGGCACCGAGACCTCCGACGTGGTGTGCAAGCCCTGCGCCCCAGGCACCTTCAGCAACACCACCTCCAGCACCGACATCTGCAGGCCCCACCAGATCTGCAACGTGGTGGCTATCCCCGGCAATGCCAGCATGGACGCCGTGTGCACCAGCACCTCCCCCACCAGAAGCATGGCCCCAGGCGCCGTGCACCTGCCCCAGCCCGTGAGCACCAGGTCCCAGCACACCCAGCCCACCCCAGAGCCTAGCACCGCCCCCTCTACCAGCTTCCTGCTGCCCATGGGCCCCAGCCCTCCAGCCGAGGGCAGCACCGGCGACGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCTCTCGAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTG TCCCCCGGCAAGTGATGA ；所述的編碼重組人TNFR-Fc融合蛋白的基因的應用，是將其重組于CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)表達系統上，在CHO細胞中進行表達；一種重組載體pIRESneo3-TNFR-Fc，通過如下方法制備得到(I)通過基因合成，得到如SEQ ID NO. I所示的編碼重組人TNFR-Fc融合蛋白的基因；(2)使用引物Fl和引物Rl對步驟(I)得到的基因進行PCR擴增，得到含有AgeI和BamHI酶切位點的基因序列；引物F I :5，-TTCTACCGGTATGGCCCCCGTGGCCGTGT-3，；引物R I :5，-CGCGGATCCTCATCACTTGCCGGGGGACAGGCT-3，；(3)用AgeI酶和BamHI酶分別雙酶切步驟(2)得到的含有AgeI和BamHI酶切位點的基因序列和載體pIRESneo3 ;再將雙酶切后得到的基因序列和載體pIRESneo3連接，得到重組載體 pIRESneo3-TNFR-Fc ；步驟(I)中所述的基因合成為通過基因合成公司進行合成；步驟(2)中所述的PCR擴增的條件優選為94°C 3分鐘；94°C 15秒、57°C 30秒、720C I分鐘，34個循環；72°C延伸5分鐘；一種轉TNFR-Fc基因的CHO細胞，為將上述重組載體pIRESneo3_TNFR-Fc轉染到CHO細胞得到；所述本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種編碼重組人TNFR？Fc融合蛋白的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：熊盛，謝秋玲，洪岸，黃亞東，陳志南，陳慧萍，
申請(專利權)人：暨南大學，
類型：發明
國別省市：
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