一株印楝內生炭角菌制造技術

本發明專利技術涉及微生物技術領域，特別是涉及一種具有廣譜抗菌活性的微生物菌株。本發明專利技術所述的印楝內生炭角菌命名為炭角菌YM311647（Xylariasp.YM311647），現保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCCNo：M2012365。該菌株為首次從印楝植物（Azadirachtaindica）中分離獲得,對2種人體致病真菌、4種植物病原真菌和3種細菌，共9種病原微生物具有比較明顯的抑制生長作用。本發明專利技術利用植物內生真菌資源，通過發酵獲得農用或醫用的新型天然抗菌藥物活性成分。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物
，特別是涉及一種具有廣譜抗菌活性的微生物菌株。
技術介紹
印楝indica A. Juss)屬楝科植物,為熱帶樹種,具有較高的生物農藥和醫藥價值。印度研究人員曾經從生長在印度的印楝植物中分離和鑒定了內生真菌(Rajagopal K et al, Current Science, 2000, 78, 1375; Mahesh B et al, CurrentScience, 2005, 88, 218; Verma VC et al, Microbial Ecology, 2007, 54, 119)。我們從生長在云南省元江縣的印楝植物中分離獲得了內生真菌，并研究了其種類組成和抗菌活性的篩選(邵士成，吳少華等，天rJf產參級貧與·萬發，2007，19, 761 ;邵士成，吳少華等，生物多樣性，2008，16, 63)。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種分離自中國云南省元江縣印楝indicaA. Juss)植物活體中具有廣譜抗菌活性的微生物菌株一印楝內生炭角菌。本專利技術所述的印楝內生炭角菌系從中國云南省元江縣印楝植物活體中分離獲得。現在國家知識產權局認可的保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏單位地址中國，武漢大學，郵政編碼430072。保藏日期為2012年9月19日，保藏編號為CCTCC No: M 2012365。本專利技術所述的印楝內生炭角菌命名為炭角菌YM311647U>7aria sp. YM311647)，現保藏在國家知識產權局認可的保藏單位，保藏編號為CCTCC No: M 2012365。菌株YM311647的固體培養特征I、PDA培養基28°C培養5d，菌落直徑達5. 2cm,菌落平展，初為白色，短絨狀，氣生菌絲呈輻射狀生長，邊緣逐漸開始變黑。15d后在菌落邊緣處出現黑色棍棒狀子座組織，形成一明顯的輪紋，邊緣呈平緩圓弧狀。2、麥芽汁培養基28°C培養5d，菌落直徑達6. 4cm，菌絲呈輻射狀生長，中央部分白色有突起，邊緣菌絲逐漸變老，呈絨毛狀。3、查氏培養基28°C培養，菌落生長緩慢，菌落初為白色，短絨狀，菌絲輻射狀生長，培養7d，菌落直徑達4. 2cm，菌落中心維持白色，邊緣開始慢慢變黑。菌株YM311647的子座形態特征(見圖I)子座環生，長I. 5cm-4. 5cm,粗I. 5 mm _2mm,大量分枝,柄長約1cm。頂端有白色不孕小尖，長約2mm。子座外部碳化為黑色，表面黑色痂質，有小孔。內部仍為白色。隨著培養時間的延長，子座變長變細，白色尖端消失。生長過程中未見子囊孢子產生。菌株YM311647的分子生物學特征采用分子生物學PCR技術，DNA序列測定分析，YM 311647菌株ITS rDNA基因組由539個堿基(bp)組成。以ITS rDNA序列為基礎構建系統發育樹，該菌與炭角菌屬具有較高的親緣關系，與已知種辦venosula的ITS rDNA序列同源性達98. 7%,有I個堿基的差異(圖2)。菌株YM311647的發酵培養特征I、培養基PDB培養基。2、培養溫度28±21。3、發酵時間7天。4、發酵培養特征培養第I天，有零星的白色菌絲點出現；培養第3天，發酵液中出現少量白色菌絲；培養第5天，白色菌絲逐漸增多，有少量菌絲帖壁；培養第7天，長滿灰白色菌絲體，發酵液粘稠。菌株YM311647的發酵工藝如下菌種——活化——一級種子(PDA培養基)——培養(28±2°C，5-7天)——接種——二級種子(PDB培養基，搖床200 r/min，28±2°C，3-4天)——接種(按5%接種量)——發酵(PDB培養基，搖床200 r/min，28±2°C，7天)——發酵物。上述發酵工藝中的發酵條件如下I、發酵方式液體發酵。2、種子培養基馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)。馬鈴薯葡萄糖液體培養基的制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水I升煮沸30分鐘，過濾，濾液加水補足至I升，加入葡萄糖20克，pH自然。上述培養基中加入15克瓊脂，即為PDA培養基。3、發酵培養基馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)。4、培養時間菌種活化培養5-7天，種子搖床培養3-4天，發酵搖床培養7天。5、培養溫度種子和發酵培養溫度均為28 ± 2 °C。6、發酵完畢，加入等體積95%乙醇浸提48小時，過濾，將濾液濃縮至干，加入無菌水制得抗菌發酵液制品。本專利技術所述的菌株YM311647的抗菌活性試驗I、病原指示菌共9株人體致病真菌包括白色念珠菌{Candida albicans)、星^形石膏樣毛癬菌、Trichophyton gypseum);植物病原真菌包括稻痕霉iPyriculariaoryzae ) >trytis ciflerea )、禾谷鍵刀菌 QFusarium《raffiifleara )、燕麥鍵抱iFusarium;細菌包括金黃色葡萄球菌{Staphylococcus atfreus)、大腸桿菌iBscherichia coli)(fseudomonas aeruginosa) ο2.病原指示菌培養基細菌類指示菌采用牛肉膏蛋白胨培養基；皮膚致病真菌類指示菌采用沙氏培養基；植物病原真菌類指示菌采用PDA培養基。3.內生真菌的培養將印楝內生炭角菌菌株YM311647接入含7 mL PDA液體培養基的三角瓶，置于28±2 ° C搖床(200 r/ min)培養7d，加入等體積95 %乙醇浸提48小時，過濾，將濾液濃縮至干，得發酵液提取物樣品備用。4.抗菌活性的測定在長有指示菌的固體斜面培養基中加入ImL無菌水，震蕩片刻制成指示菌懸液。將發酵液提取物樣品用無菌水溶解，配制成濃度為lmg/mL的溶液，用PDB液體培養基將樣品分別倍比稀釋為 6 個濃度lmg/mL、500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62. 5mg/mL、31. 25mg/mL。按每孔50μ 將樣品分別加入到96孔板中，再向每孔中加入50μ 活性指示菌菌懸液，以不加菌液的孔為空白對照，設置3個平行處理。將96孔板置于28 ±1°C(真菌)或37±1°C(細菌)培養箱中培養24 h后，肉眼觀測活性指示菌的生長狀況，以沒有指示菌生長的樣品最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)。結果顯示，菌株YM311647的發酵液提取物樣品對9種病原指示菌白色念珠菌、星形石膏樣毛癬菌、稻瘟霉、灰葡萄孢、禾谷鐮刀菌、燕麥鐮孢、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠色假單孢菌的MIC值分別為62. 5、125、250、125、125、250、62. 5、31. 25、250mg/mL。本專利技術首次從印楝植物(Azadirach ta indi ca)中分離獲得內生真菌菌株YM311647，確定為炭角菌)，發現該菌對2種人體致病真菌、4種植物病原真菌和3種細菌，共9種病原微生物具有比較明顯的抑制生長作用。本專利技術利用植物內生真菌資源，通過發酵獲得農用或醫用新型天然抗菌藥物活性成分。附圖說明圖I為本專利技術所述的炭角菌YM311647的子座形態特征。圖2為本專利技術所述的炭角菌YM311647同源性的系統發育樹圖。具體實施例方式實施例一炭角菌YM311647菌株是通過發酵獲得農用或醫用新型天然抗菌藥物活性成分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種印楝內生炭角菌，其特征在于命名為炭角菌YM311647（Xylaria？sp.？YM311647），現保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC？No：M？2012365。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳少華，苗翠蘋，陳有為，
申請(專利權)人：云南大學，
類型：發明
國別省市：