本發明專利技術公開了一種白地霉ZJB-09214及在生物催化合成L-色氨酸中的應用，所述的應用以外消旋色氨酰胺為底物，以白地霉ZJB-09214發酵培養獲得的上清液a為酶源，于pH?6.5~9.0的緩沖溶液中構成反應體系，在20~?45℃下轉化反應2~8?h，轉化率大于40%，光學純度大于99%；本發明專利技術提供了一種產胞外酰胺酶的白地霉ZJB-09214新菌株，酶活回收容易；利用該菌株所產胞外酰胺酶可制備高光學純度的L-色氨酸，反應條件溫和，環境友好。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及色氨酸合成方法，特別涉及一種產酰胺酶的新菌種一白地霉 ZJB-09214 (Geotrichum candidum ZJB-09214)及在生物催化制備L-色氨酸中的應用。
技術介紹
酰胺酶(Amidase，EC3. 5. I. 4)是一類催化酰胺C-N鍵水解生成相應羧酸和氨的重要生物催化劑。酰胺酶底物譜廣，能高效催化各種非天然脂肪族、雜環及芳香族酰胺的水解，并具有高度化學選擇性、區域選擇性、立體選擇性和不需輔酶等優點，在制備復雜結構手性羧酸及酰胺衍生物中具有獨特優勢。因此，獲得酰胺酶新酶源在手性生物合成中具有十分重要的價值。目前已報道的酰胺酶產生菌主要為Rhodococcus、Bacillus、Pseudomonas、 Paracoccus、Comamonas、Pseudonocardia 等細菌(Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 2009,8: 343-366)ο僅Prasad和Linardi等報道了少數產酸胺酶的酵母如Kluyveromyces thermotolerans、 Candida famata 等(World J. Microbiol. Biotechnol. 2005,21: 1447-1450, FEMS Microbiol. Lett. 1996, 15:67-71)。色氨酸化學名為α -氨基-β -吲哚丙酸，是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸。 L-色氨酸是人和動物所需的重要限制性氨基酸之一，參與肌體蛋白質合成和代謝網絡調節，在生長發育中發揮著重要作用。因此，L-色氨酸被廣泛用于醫藥、飼料和食品等行業， 是繼蛋氨酸、賴氨酸之后的第三大飼料添加用氨基酸。通過添加L-色氨酸，能夠調節日糧中氨基酸的平衡，促進禽畜的生長。L-色氨酸生產方法主要有發酵法、化學合成法和酶促轉化法。發酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉價原料為碳源，利用谷氨酸棒桿菌、枯草桿菌生產 L-色氨酸，但合成途徑長，代謝流較弱，且需多種前體物質?；瘜W合成法主要有直接以吲哚為原料及在合成過程中生成吲哚兩大類。該法反應條件復雜，周期長，污染嚴重，不宜工業化生產。酶促轉化法具有終產物積累量高、反應周期短、分離提純容易等優點，是生產廉價 L-色氨酸的有效方法。酶促工藝中涉及的酶催化劑主要有氨基酸?；?、轉氨酶、海因酶、 色氨酸酶、絲氨酸消旋酶和色氨酸合成酶等。
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種新菌株——白地霉ZJB-09214，及其在生物轉化制備L-色氨酸中的應用。本專利技術采用的技術方案是白地霉ZJB-09214 (Geotrichum candidum ZJB-09214)保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，保藏日期2012年3月7日，保藏編號CCTCC No M 2012063。本專利技術所述白地霉ZJB-09214是通過以下程序篩選得到的I)將從浙江省杭州市周邊地區采回的土樣1.0 g加入生理鹽水中，用振蕩器充分打散均勻并接種到富集培養基，在30°C、150 rpm下，搖床培養4飛天后，移取2 ml富集培養液轉入新鮮的富集培養基中，再在同樣條件下培養4 5天，如此重復3 4次；富集培養基終濃度組成為(g/L):葡萄糖 6. (KK2HPO4 2. O, NaCl I. O、MgSO4 · 7H20 O. 2、FeSO4 · 7H200.01、生物素O. 001、鹽酸硫胺O. 001、丙烯酰胺2.0，pH 7.0，溶劑為水。2)取最后一次富集培養液用質量濃度O. 85%生理鹽水稀釋IO6IOki倍后涂布到平板培養基上，在30°C培養2天，挑取單菌落接種至斜面培養基，在30°C培養2天，獲得菌體斜面。平板培養基為富集培養基中加入質量濃度I. 7%的瓊脂。斜面培養基終濃度組成為(g/L) =KH2PO4 I. O, MgSO4 · 7H20 O. 5，NaNO3 2. O, KCl O. 5，FeSO4 O. 01，蔗糖 30. 0，瓊脂 18. 0，pH為7.0，溶劑為水。3)挑取一接種環斜面菌體接種至發酵培養基，在25 45°C、10(T300 rpm下，搖瓶培養48 72小時，將發酵液離心，獲得濕菌體(即沉淀)和上清液。然后根據浙江工業大學鄭裕國等(Appl. Microbiol. Biotechnol. , 2007, 74 :256_262)所述的立體選擇性酸胺酶篩選方法進行產酰胺酶菌株的篩選，最終獲得產酰胺酶菌株一白地霉ZJB-09214。發酵培養基終濃度組成為(g/L):葡萄糖10.0 20.0，酵母膏5. 0 10. 0，蛋白胨2. 0 5. 0，K2HPO41.0 2· O, KH2PO4 I. 0 2· O, MgSO4 · 7Η20 0. 2 0. 5，FeSO4 · 7Η20 0. θΓθ. 05，NaCl I. 0 3· O,乙酰胺I. 0 3· O, pH 6. 0 8· 5，溶劑為水(121 0C下，滅菌20 min)；本專利技術所述白地霉Z JB-09214的鑒定a)菌株形態和生理生化特征I)形態特征菌落形態28 °C培養5天，在PDA培養基上菌落呈平面擴散，直徑4 cm左右，扁平，短絨狀，有同心圓，呈放射狀，中心突起。菌絲形態有真菌絲，兩支分叉，橫隔少。節孢子連接成鏈，橢圓形，末端圓鈍。2)生理生化特征見表I。表I白地霉ZJB-09124的生理生化特征權利要求1.白地霉ZJB-09214(Geotrichum candidum)保藏于中國典型培養物保藏中心，地址 中國武漢武漢大學，保藏日期2012年3月7日，保藏編號CCTCC No M 2012063。2.權利要求I所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的應用，其特征在于所述的應用為以外消旋色氨酰胺為底物，以白地霉ZJB-09214發酵培養獲得的酶為酶源， 于pH 6. 5、. O的緩沖溶液存在的反應體系中，在20 45°C下轉化反應獲得的轉化反應液即為含L-色氨酸的混合液，將混合液分離純化得到L-色氨酸。3.如權利要求2所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的應用，其特征在于所述酶源為以白地霉ZJB-09214發酵培養獲得的含濕菌體發酵液離心后取得的上清液為酶源。4.如權利要求3所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的應用，其特征在于所述酶源按如下方法獲得將白地霉ZJB-09214接種于發酵培養基中，25 45°C 下，10(T300 rpm振蕩培養48 72小時，獲得含濕菌體的發酵液，將發酵液離心，棄去沉淀，取上清液，即獲得酶源；所述發酵培養基終濃度組成為葡萄糖10. (Γ20. Og/L，酵母粉8.0 16· O g/L，蛋白胨 2. 0 5· O g/L, K2HPO4 O. 5 2. O g/L,KH2PO4 O. 5 2. O g/L,MgSO4 ·7Η200.2 O. 5 g/L, NaCl I. 0 3· O g/L，乙酰胺 3· 0 8· 0 g/L, pH 6· 0 8· 5，溶劑為水。5.如權利要求2所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的應用，其特征在于所述pH 6. 5^9. O的緩沖溶液為pH 6. 5本文檔來自技高網...
【技術保護點】
白地霉ZJB？09214（Geotrichum？candidum）保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國？武漢？武漢大學，保藏日期2012年3月7日，保藏編號CCTCC？No：M？2012063。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭裕國，鄭仁朝，沈寅初，
申請(專利權)人：浙江工業大學，
類型：發明
國別省市：
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