人工麝香的多肽電泳圖譜檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種中藥檢測方法，具體涉及一種人工麝香的多肽電泳圖譜檢測方法。本發明專利技術采用電泳上樣緩沖液直接提取分析，每個樣品的用量僅需幾毫克，該方法為人工麝香的鑒別建立了一種簡便可行的輔助手段。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種中藥檢測方法，具體涉及一種人工麝香的多肽電泳圖譜檢測方法。
技術介紹
麝香具有一定的抗炎鎮痛藥理活性，現有研究顯示麝香的抗炎活性與麝香中特有的糖肽有關，不同文獻報道其抗炎糖肽分子量各不相同，不同來源的麝香其多肽成分有顯著性差異。常規的電泳分析體系Tris-甘氨酸-SDS-PAGE電泳分析分辨大分子物質的相對分子質量范圍在l(T200kDa，對于相對分子質量小于IOkDa的多肽分辨率低。利用含有SDS的凝膠中加入高濃度脲時可利用SDS-PAGE對小分子多肽進行分析的分離效果不甚理想，且重現性較差，且小分子多肽在固定染色的過程中容易丟失。故采用Tricine-SDS-PAGE電泳，建立麝香多肽電泳方法。
技術實現思路
本專利技術提供了一種。本專利技術目的是通過如下技術方案實現的I、人工麝香凝膠電泳分析樣品的制備稱取人工麝香樣品O. 003^0. 008重量份，加入I體積份乙醚，超聲提取15 25min，離心去上清，揮干乙醚，不溶物加O. 03、. 08體積份電泳上樣緩沖液(IX)，超聲提取15 25min,在4500rpm, 10°C條件下離心15 25min,取上清,加O. 02%溴酹藍,沸水浴3 8min,即得電泳樣品；2、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析方法(I)電泳溶液準備(a)去離子水溶解100 150重量份Tris，用HCl調PH值至7 9，定容至500體積份，制得正極緩沖液(IOX);(b)去離子水溶解50 70重量份Tris，8(Tl00重量份1^(^1^，3 8重量份505，定容至500體積份，制得負極緩沖液(10 X );(C)去離子水溶解150 200重量份Tris，l 2重量份SDS，用HCl調PH值至疒9，定容至500體積份，制得凝膠緩沖液(3X )；(d) 40^60%丙烯酰胺，Γ2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲液；(e)4(T60%丙烯酰胺，Γδ%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲液；(f)0. 2 I體積份lmol/L, PH為6. 8的Tris-HCl, 2^4體積份甘油，I 3體積份10%SDS，0. 6^1體積份β -巰基乙醇，O. 5^1. 5體積份1%溴酚藍，加蒸餾水補足10體積份，制得上樣緩沖液^X);(g) O. 2 I體積份lmol/L, PH為6. 8的Tris-HCl，2 4體積份甘油，I 3體積份10%SDS，0.6 1體積份β -巰基乙醇，加蒸餾水補足60體積份，制得上樣緩沖液(IX);(2)凝膠制備分離膠3體積份取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，O. 2^0. 6重量份甘油，O. 5^1. 5體積份6C丙烯酰胺儲液，去離子水稀釋至2 4體積份，臨用時加入O. 005、. 02體積份的10%過硫酸銨溶液和O. 0005、. 002體積份TEMED ；夾層膠3體積份取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ)0. 5^1. 5體積份，O. 5^0. 8體積份3C丙烯酰胺儲液，去離子水稀釋至2 4體積份，臨用時加入O. 005、. 02體積份的10%過硫酸銨溶液和O. 0005、. 002體積份TEMED ；濃縮膠2體積份0. 4^0. 6體積份凝膠緩沖液(3X)，0. Γθ. 2體積份3C儲液，去離子水稀釋至廣3體積份，臨用時加入O. 005、. 02體積份的10%過硫酸銨溶液和O. 0005 O. 002 體積份 TEMED ；(3 )電泳條件120V恒壓電泳至溴酚藍距凝膠底部Icm處；(4)染色方法采用靈敏度高的銀染，以下溶液臨用前配制固定液量取甲醇30-60體積份，冰醋酸5-20體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；染色液稱取O. 5^1. O重量份AgNO3溶于3飛體積份雙蒸水中；取潔凈燒杯，加入O. 36% NaOH 15 30體積份，再加入氨水I 2體積份混勻，將制備好的AgNO3溶液逐滴加入，邊加邊攪拌，全部加入后，加雙蒸水至100體積份；顯色液0. 3^0. 8體積份I %檸檬酸，O. 03、. 08體積份甲醛，加雙蒸水至100體積份；終止液量取冰醋酸I體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；3、具體染色步驟(a)電泳結束后，將凝膠轉移至固定液中固定O. 5^1. 5h，每l(T30min換一次液；(b)棄去固定液，凝膠以雙蒸水中漂洗3次，每次5 15min ；(c)將膠移入一個干凈的容器內，染色液中輕搖染色1(Γ20分鐘；(d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗2 4min ；(e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液；(f)將膠轉移至終止液終止染色；(g)在蒸餾水中漂洗凝膠O. 5^1. 5h ；(h)進行凝膠掃描或將凝膠進行干膠保存；在人工麝香電泳圖譜中，出現分子量約為91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、lL 3kDa的染色條帶。本專利技術優選如下步驟I、人工麝香凝膠電泳分析樣品的制備稱取人工麝香樣品O. 003重量份，加入I體積份乙醚，超聲提取20min，離心去上清，揮干乙醚，不溶物加O. 05體積份電泳上樣緩沖液(IX),超聲提取20min,在4500rpm,10°C條件下離心20min,取上清,加O. 02%溴酹藍,沸水浴5min,即得電泳樣品；2、Tricine-SDS-PA重量份E凝膠電泳分析方法(I)電泳溶液準備(a)去離子水溶解100重量份Tris，用HCl調PH值至7. 5，定容至500體積份，制得正極緩沖液(IOX);(b)去離子水溶解55重量份Tris，90重量份Tricine，8重量份SDS，定容至500體積份，制得負極緩沖液(10 X );(c)去離子水溶解160重量份Tris，I. 5重量份SDS，用HCl調PH值至7. 8，定容至500體積份，制得凝膠緩沖液(3X )；(d) 56%丙烯酰胺，I. 2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲 液；(e) 52%丙烯酰胺，2. 0%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲液；(f) O. 8 體積份 lmol/L, PH 為 6. 8 的 Tris-HCl, 2 體積份甘油，3 體積份 10%SDS,O. 7體積份β -巰基乙醇，I. 5體積份1%溴酚藍，加蒸餾水補足10體積份，制得上樣緩沖液(6Χ)；(g) O. 4 體積份 lmol/L, PH 為 6. 8 的 Tris-HCl，2 體積份甘油，2. 5 體積份 10%SDS,I體積份β -巰基乙醇，加蒸餾水補足60體積份，制得上樣緩沖液(IX);(2)凝膠制備分離膠3體積份取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，O. 6重量份甘油，I. 5體積份6C丙烯酰胺儲液，去離子水稀釋至4體積份，臨用時加入O. 005體積份的10%過硫酸銨溶液和O. 001體積份TEMED ；夾層膠3體積份取上述制得的凝膠緩沖液(3Χ) I體積份，O. 5體積份3C丙烯酰胺儲液，去離子水稀釋至2. 5體積份，臨用時加入O. 005體積份的10%過硫酸銨溶液和O. 001體積份的TEMED ；濃縮膠2體積份取上述制得的O. 6體積份凝膠緩沖液(3Χ)，0. 2體積份3C丙烯酰胺儲液，去離子水稀釋至2體積份，臨用時加入O. 005體積本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人工麝香的多肽電泳圖譜檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟：A、人工麝香凝膠電泳分析樣品的制備稱取人工麝香樣品0.003~0.008重量份，加入1體積份乙醚，超聲提取15~25min，離心去上清，揮干乙醚，不溶物加0.03~0.08體積份電泳上樣緩沖液（1X），超聲提取15~25min，在4500rpm，10℃條件下離心15~25min，取上清，加0.02%溴酚藍，沸水浴3~8min，即得電泳樣品；B、Tricine？SDS？PAGE凝膠電泳分析方法（1）電泳溶液準備：(a)去離子水溶解100~150重量份Tris，用HCl調PH值至7~9，定容至500體積份，制得正極緩沖液（10×）；(b)去離子水溶解50~70重量份Tris，80~100重量份Tricine，3~8重量份SDS，定容至500體積份，制得負極緩沖液（10×）；(c)去離子水溶解150~200重量份Tris，1~2重量份SDS，用HCl調PH值至7~9，定容至500體積份，制得凝膠緩沖液（3×）；(d)40~60%丙烯酰胺，1~2%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得3C丙烯酰胺儲液；(e)40~60%丙烯酰胺，1~5%甲叉丙烯酰胺，加入去離子水溶解，制得6C丙烯酰胺儲液；(f)0.2~1體積份1mol/L，PH為6.8的Tris？HCl，2~4體積份甘油，1~3體積份10%SDS，0.6~1體積份β–巰基乙醇，0.5~1.5體積份1%溴酚藍，加蒸餾水補足10體積份，制得上樣緩沖液(6×)；(g)0.2~1體積份1mol/L，PH為6.8的Tris？HCl，2~4體積份甘油，1~3體積份10%SDS，0.6~1體積份β巰基乙醇，加蒸餾水補足60體積份，制得上樣緩沖液(1×)；（2）凝膠制備：分離膠3體積份：取上述制得的凝膠緩沖液(3×)1體積份，0.2~0.6重量份甘油，0.5~1.5體積份6C丙烯酰胺儲液，去離子水稀釋至2~4體積份，臨用時加入0.005~0.02體積份的10%過硫酸銨溶液和0.0005~0.002體積份TEMED；夾層膠3體積份：取上述制得的凝膠緩沖液(3×)0.5~1.5體積份，0.5~0.8體積份3C丙烯酰胺儲液，去離子水稀釋至2~4體積份,臨用時加入0.005~0.02體積份的10%過硫酸銨溶液和0.0005~0.002體積份TEMED；濃縮膠2體積份：0.4~0.6體積份凝膠緩沖液(3×)，0.1~0.2體積份3C儲液，去離子水稀釋至1~3體積份，臨用時加入0.005~0.02體積份的10%過硫酸銨溶液和0.0005~0.002體積份TEMED；（3）電泳條件：120V恒壓電泳至溴酚藍距凝膠底部1cm處;（4）染色方法采用靈敏度高的銀染，以下溶液臨用前配制：固定液：量取甲醇30？60體積份，冰醋酸5？20體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；染色液：稱取0.5~1.0重量份AgNO3溶于3~5體積份雙蒸水中；取潔凈燒杯，加入0.36%NaOH？15~30體積份，再加入氨水1~2體積份混勻，將制備好的AgNO3溶液逐滴加入，邊加邊攪拌，全部加入后，加雙蒸水至100體積份；顯色液：0.3~0.8體積份1﹪檸檬酸，0.03~0.08體積份甲醛，加雙蒸水至100體積份；終止液：量取冰醋酸1體積份，加雙蒸水稀釋至100體積份；C、具體染色步驟：(a)電泳結束后，將凝膠轉移至固定液中固定0.5~1.5h，每10~30min換一次液；(b)棄去固定液，凝膠以雙蒸水中漂洗3次，每次5~15min；(c)將膠移入一個干凈的容器內，染色液中輕搖染色10~20分鐘；(d)棄去染色液，加雙蒸水震蕩漂洗2~4min；(e)將膠移至顯色液中輕搖顯色，至色帶清晰，棄去顯色液；(f)將膠轉移至終止液終止染色；(g)在蒸餾水中漂洗凝膠0.5~1.5h；(h)進行凝膠掃描或將凝膠進行干膠保存;在人工麝香電泳圖譜中，出現分子量為91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、11.3kDa的染色條帶。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：潘杰，黃進明，于娟，洪緋，袁慧君，
申請(專利權)人：漳州片仔癀藥業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：