綴合的凝血因子VIII制造技術

本發明專利技術提供了一種生物相容性聚合物，該生物相容性聚合物通過一個或多個半胱氨酸殘基與FVIII綴合，適當地通過FVIII中還原的二硫鍵間的連接基與FVIII綴合，本發明專利技術還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有這種綴合形式的FVIII。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及綴合形式的凝血因子VIII。
技術介紹
因子VIII (FVIII)是必不可少的凝血因子，也被稱為抗血友病因子(AHF)。對人類而言，因子VIII由F8基因編碼。在該基因上的缺陷會導致血友病A，這是一種眾所周知的隱性X染色體連鎖的凝血異常，影響著大約1/5000的男性。X染色體連鎖的F8基因編碼來自26個外顯子的具有2351個氨基酸的多肽，該多肽在被切割了信號肽之后形成具有2332個氨基酸的成熟FVIII分子(Wang et al. Int.J. Pharmaceutics, 259:1-15 (2003))。已經發現FVIII被合成并通過肝臟的血管細胞、血管小球細胞(glomerular cells)、管狀內皮細胞(tubular endothelium cells)和竇內皮細·胞(sinusoidal cells)釋放到血液中,但是人體內FVIII的初始釋放位點在哪里仍然存在很大爭議。FVIII分子由六個蛋白結構域組成；NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。成熟的分子含有許多翻譯后修飾，包括N-連接和O-連接的糖基化，磺基化以及二硫鍵的形成。FVIII總共含有23個半胱氨酸殘基，其中16個半胱氨酸殘基在蛋白質的A和C結構域中形成了 8個二硫鍵(McMullen et al. Protein Science, 4:740-746 (1995))。由于蛋白質的翻譯后修飾，基于糖基化的水平和類型，它的循環分子量(circulation molecular weight)能夠多達330kDa。FVIII也會經歷蛋白水解過程，從而使得血液循環中的種類是由重鏈(A1-A2-B)和輕鏈(A3-C1-C2)組成的異二聚體。當FVIII被分泌進入血液循環時，它以非共價的形式與血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vffF)結合。兩個分子的結合涉及FVIII的輕鏈的 A3 和 C2 結構域(Lacroix-Desmazes et al. Blood, 112:240-249 (2008))。與 vWF 的結合增加了 FVIII的穩定性和循環半衰期(circulatinghalf-life)。雖然與vWF的結合能夠增加FVIII的循環半衰期，它的天然半衰期僅為15-19小時。因子VIII是參與內源性凝血途徑必不可少的輔因子。在凝血級聯反應中它的作用是作為“成核模板”，以使得FX酶復合物的組分在活化的血小板的表面以正確的空間方向有機排布(Shen et al. Blood, 111:1240-1247(2008))。FVIII 首先由凝血酶(因子 II a)或者FXa活化，然后它以FVIIIa的形式從vWF解離。然后，FVIIIa在血管損傷的位置與活化的血小板結合，并通過A2和A3介導的相互作用與FIXa結合。當血小板表面存在Ca2+離子時，FIXa與FVIII的結合使得FIXa的蛋白水解活性增加了大約200000倍。然后，該復合物將FX活化為FXa。然后因子Xa和它的輔因子因子Va活化更多的凝血酶。凝血酶轉而將纖維蛋白原切割為纖維蛋白，然后纖維蛋白聚合并交聯(利用因子XIII)成為纖維蛋白血塊。由于不再受vWF的保護，在過程中活化的FVIII被蛋白水解而失活(最主要是通過活化的蛋白質C和因子IXa)并迅速從血流中被清除。蛋白質聚乙二醇化方法已由PolyTherics有限公司開發,并被稱為TheraPEG ,在該產品中，通過蛋白質中的一對半胱氨酸殘基的還原型二硫鍵，PEG聚合物與目的蛋白相連接(WO 2005/007197)。這一技術已被用于制備無因子FIXa污染的因子IX的聚乙二醇化變體(WO 2009/130602)。然而，對于使用同樣的技術制備聚乙二醇化的FVIII而言，則被認為是重要的或者非常規的。從活性角度來看，FVIII與FIX存在某些關鍵的區別，這就意味著這種蛋白質和生物相容性聚合物的綴合并不是一個簡單的步驟。例如，FIXa是一種絲氨酸蛋白酶，而FVIII則沒有酶活性。一旦活化，FIX僅需要與它的輔因子形成結合，而FVIII則需要參與凝血級聯反應。而且，FVIII是輔因子，且能夠形成“模板”，其它凝血因子(包括FIXa)組裝在該“模板”上從而增強它們的催化活性。為了發揮FVIII的功能，它必須能夠與FX、FXa、FIXa和磷脂相結合。而且，為了使FVIII在血液循環中穩定，它必須能夠與血管性血友病因子結合。因此，由于實現分子間相互作用的FVIII所有的結構域中都有二硫化物存在，該蛋白的半胱氨酸殘基上的二硫化物進行聚乙二醇化就會在空間上阻礙這些相互作用。因而，因子FVIII的聚乙二醇化存在一些不同于FIX的獨特的和不同的挑戰。使用TheraPEG 技術對FIX進行聚乙二醇化獲得成功的事實，對于使用同樣的方法能否成功制備聚乙二醇化的FVIII而言并沒有指導意義，因為FVIII是結構和功能上都不相同的蛋白質。已經發現，通過將FVIII和一種或多種生物相容性聚合物綴合可以增強因子VIIK本文中稱為FVIII)的操作性。增強的操作性能也包括制備高純度FVIII綴合物的能力。
技術實現思路
根據本專利技術的第一方面，提供了通過一個或多個半胱氨酸殘基與FVIII綴合的生物相容性聚合物。生物相容性聚合物可選自由聚乙二醇(PEG)、聚磷脂酰膽堿(PC)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚環氧乙烷(PEO)、聚氧乙烯醇(polyoxyethylated polyol)、聚烯 IKpolyolefinic alcohol)、聚輕燒基丙烯酸甲酯(polyhydroxyalkylmethacrylate)、多糖、聚α _輕基酸、聚乙烯醇、聚磷腈(polyphosphosphasphazene)、聚 N-丙烯酰嗎啉、聚烯烴氧化物聚合物(polyalkyene oxidepolymers)、聚馬來酸、聚DL-丙氨酸、羧甲基纖維素、右旋糖酐、淀粉或淀粉衍生物、透明質酸甲殼素(hyaluronic acid chitin)、聚甲基丙烯酸酯、聚唾液酸(PSA)、聚輕基羧酸鈉(polyhydroxy alkanoates)、聚氨基酸以及它們的組合組成的組中。所述生物相容性聚合物可以具有線性或分支狀結構。在另一種實施方式中，所述生物相容性聚合物為蛋白質，選自但不限于由FVII、·白蛋白、轉鐵蛋白、免疫球蛋白(包括單克隆抗體)、抗體片段如單結構域抗體、\、VH、Fab、F(ab，)2、Fab’、Fab3、scFv、di-scFv、sdAb、Fe 以及它們的組合組成的組中。如果需要，每個FVIII分子可以通過一個或多個半胱氨酸殘基與一種或多種生物相容性聚合物綴合。游離的半胱氨酸殘基是還原胱氨酸二硫鍵的產物。本專利技術的生物相容性聚合物可以通過一個或多個還原的半胱氨酸二硫鍵與FVIII綴合。所述綴合可以是通過將FVIII中形成二硫鍵的兩個半胱氨酸殘基的硫殘基橋接的連接基團的方式。因而，二硫鍵可以是天然二硫鍵或者是重組引入的二硫鍵。PEG分子可以具有任何適當的分子量，例如5-100kDa，10_500kDa。適當地為5-30kDa或者10-30kDa。某些適當的分子量包括10、20或者30本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：W·亨利，
申請(專利權)人：劍橋生物制藥專利有限公司，
類型：
國別省市：