本文闡述結合有工業意義的小靶標分子的小肽結構域和共有序列，所述有工業意義的小靶標分子例如金屬例如鎳、β胡蘿卜素和異黃酮例如染料木黃酮。同樣闡述含有所述結合結構域的融合蛋白，所述結合結構域與蛋白質或與肽結構域例如GST或CBD融合，所述蛋白質或肽結構域結合其它配體，可用于將所述靶標結合結構域固定在支持體上。可用于工業環境的融合蛋白中的一類是含有靶標結合結構域串聯體的融合體，所述融合體增加每分子的結合當量。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】結合有工業意義的小分子的肽結構域相關申請的交叉引用 本申請要求于2010年I月29日提交的美國專利申請序列號61/299，449的申請日權益，其公開內容通過引用并入本文中。背景 一直在將能夠結合特異性靶標分子的肽用于生物學、醫學、制藥領域的各類研究和產品開發工作中。在這些領域中，靶標分子通常是具有生物學意義的分子，例如病變細胞或致病細胞的肽表位、表面受體蛋白、信號轉導蛋白、在生物學應答例如免疫T細胞和B細胞應答的病因學中涉及的蛋白質和用于生物學研究的靶標，例如與核酸結合的蛋白質或為鑒定和篩選目的需要特異性結合配體的生物學感興趣的其它蛋白質。為獲得具有特定靶標結合活性的肽而最長期使用的工具來自對免疫反應的開發，·最初是通過獲得多克隆抗體，例如通過注射靶標分子攻擊動物以獲得B細胞應答來誘導IgG和IgM，并從血液中分離抗體。隨后，從雜交瘤細胞克隆中獲得單克隆抗體，所述雜交瘤細胞克隆產生結合靶標分子的特定表位的單一種類的抗體。有用的抗體具有以通常為10_7M或更小、更通常為10_8 M-10_9M的摩爾解離常數(Kd)結合靶標分子的能力。這些技術完全依靠開發天然生物免疫系統，所述系統能夠重組抗體高可變結構域的編碼序列以產生極為多樣化的抗體，并具有天然刺激與目的靶標分子結合的少量抗體增殖的能力。就單克隆抗體而言，天然誘導的增殖被人為的選擇和培養表達特異性抗體的克隆的能力所取代。盡管已經證明使用抗體成為用于獲得結合特定靶標分子的肽的強大工具，但抗體的工業應用的效用受到限制。首先，抗體必須由全血、雞蛋或雜交瘤組織培養物制備，與結合靶標分子的工業規模需求相比，所有這些都是昂貴而低產量的生產系統。其次，它們依賴在抗體分子高可變區形成的結合結構域的三維結構，這需要生產相當大的蛋白質(即使是單鏈可變片段情況下)，以獲得結合每一摩爾靶標分子所需的相對較小的肽結構域的I摩爾結合當量。最近，用于鑒定靶標結合結構域的抗體的較新的備選品是開發細菌蛋白展示系統，最值得注意的是噬菌體展示系統。這些系統以與表面蛋白的融合蛋白的形式來展示肽或整個蛋白的序列，例如對于噬菌體展示，將肽表達為與噬菌體顆粒蛋白的融合蛋白。噬菌體展示是用于探索組合隨機肽文庫的序列空間的最強大和完善的技術之一。通常外源蛋白/肽作為與次要外殼蛋白PlII或主要外殼蛋白PVIII的融合蛋白表達于M13噬菌體表面上。可針對靶標分子(固定在珠粒上或吸附于微量滴定板孔中)篩選具IO7-IO11多樣性肽(具有5-40個殘基)的文庫，經過結合和感染的反復輪次富集特定的結合物。通過ELISA檢測富集池中單個克隆的結合，通過測定噬菌體顆粒中的DNA序列來解碼結合肽的氨基酸序列。然后可將肽配體的氨基酸序列與蛋白質數據庫比較，以計算機鑒定潛在的內源互作蛋白。噬菌體展示技術主要用于鑒定蛋白質-蛋白質、蛋白質-肽和蛋白質-DNA的相互作用，因此，尤其用作鑒定靶標肽的研究工具，所述靶標肽與生理學重要的蛋白例如抗體和受體相互作用，或與特定DNA序列結合，或與潛在候選藥物結合以便發現用于藥物應用的潛在生理學靶標蛋白。然而，很少將噬菌體展示用于鑒定與有工業意義的小分子結合的肽，所述有工業意義的小分子例如在工業生產液流中的污染物或金屬離子。盡管作為研究工具有用，但一直未顯示噬菌體展示作為實際生產用于在任何工業加工或產品方面的商業部署的肽結構域的工具的實用性。然而，業已闡述少數金屬結合肽。在金屬結合肽中發現的一種金屬結合基序為6個組氨酸(“多組氨酸”)的序列，已知其能夠結合鎳。可獲得含有其中啟動子與編碼含多組氨酸的肽的區域連接的核酸序列的表達載體，以制備所謂的“組氨酸-標簽”融合蛋白，所述融合蛋白可通過依靠多組氨酸結構域結合固定在柱上的鎳的能力自細胞提取物中快速分離。用過量咪唑從柱中洗脫結合的蛋白。如果克隆載體在融合蛋白框架內另外編碼蛋白酶底物位點，則可用蛋白酶將多組氨酸結合結構域自洗脫蛋白裂解。最為人知曉的多組氨酸結合結構域是包含6個組氨酸核心序列的肽，如以序列YSHHHHHHLAGTA (SEQ ID NO 1)為例所示，其對鎳的摩爾解離常數為2. 3 χ 1(Γη Μ。另外一種已知多組氨酸結合結構域為組氨酸-谷氨酰胺二肽的6聚體重復的12個氨基酸的肽，即(HQ)6 (SEQ ID NO :2)，精氨酸也表明是在鎳結合中起重要作用的氨基酸殘基，因為亦顯 示共有序列RHXHHR (SEQ ID NO 3)(其中X最常為組氨酸)以高親和力結合鎳(Jie等，Chemical Biology & Drug Design (2006) 68 .-107-112) 0 Jie 等人通過篩選形成經工程改造以在鞭毛上展示蛋白的細菌文庫的肽鑒定了該序列，并提示展示所述序列的細菌可能用作生物衍生的廢水修復劑(remediation agent)。Behnaz 等人(Zra/ ia/ /otfraaJ of Biotechnology (2005) J ..7洲-765)用相似的系統揭示結合金屬的肽的極為不同的基序，其顯示經由纖毛(fibrinea)融合蛋白展示于大腸桿菌(疋co7i)表面上的富半胱氨酸肽GCGCPCGCG (SEQ ID NO :4)，能夠以相對次序鉛〉鎘〉鎳結合金屬。關于半胱氨酸，顯示通過與OmpX膜蛋白融合在其表面展示含半胱氨酸肽LCCYWSYSRMCKN(SEQ ID NO :5)(選自隨機產生的11-聚體文庫，11-聚體中，2個半胱氨酸被7個氨基酸分開且每一個側翼有2個氨基酸)的大腸桿菌，與懸浮液中的金顆粒結 (Kaviani, Biological Applications NNIN REU (2006) Research Accomplishments,第12-13頁)。通過噬菌體展示用M13鑒定了序列LKAHLPPSRLPS (SEQ ID NO 6)的含脯氨酸/羥基金結合肽(Nam等，Science (2006)312:885-888)。同樣地但在不相關的工作中顯示，通過噬菌體表面展示鑒定的幾個富含羥基但沒有特定共有序列的肽結合鋁，其中肽VPSSGPQDTRTT(SEQ ID NO 7)顯示特別強的結合(Zao 等，Appl. Microb. and Biotech.(2005) CU防-見功。業已提議金結合肽可能用于微電子納米結構的組裝。其他人證明在M13噬菌體文庫上展示的金屬結合肽可用作改進催化活性的生物模板催化劑(Nelner等，ACS Nano (2010) 4 :3227-3235、。盡管有這些建議，但是單獨的噬菌體展示或其它細菌展示系統還不適于在實際工業規模處理中部署，所述實際工業規模處理例如水修復、回收貴重金屬或從工業生產液流中去除污染物。這是因為結合工業規模工業生產液流中的靶標分子所需的結合位點的量非常大。舉例而言，經由細菌細胞培養物產生的典型噬菌體滴度大約為IO12顆粒/mL。即使假定每個顆粒展示IO3個結合蛋白，每個蛋白結合一當量靶標分子，這需要6. 02 χ IO8 mL或602，000升細胞培養物以產生足夠多的顆粒僅僅結合I摩爾靶標分子。I摩爾鎳是60g的材料，典型的水密集型工業生產加工例如在濕磨設備中每天加工250，000蒲式耳本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：TP賓德，AG勞，山本康文，P漢克，
申請(專利權)人：阿切爾丹尼爾斯密德蘭公司，衣阿華州立大學研究基金公司，
類型：
國別省市：
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