一種小分子親和肽及其應用制造技術

本發(fā)明專利技術涉及分子生物學領域，具體地，本發(fā)明專利技術涉及一種小分子肽及其應用。本發(fā)明專利技術的小分子親和肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1-18中的任一項所示。根據(jù)本發(fā)明專利技術的小分子親和肽，其與人免疫球蛋白IgG的Fc片段結(jié)合。采用本發(fā)明專利技術的小分子親和肽作為親和配體，可以實現(xiàn)高效、安全、經(jīng)濟的IgG分離純化。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及分子生物學領域，具體地，本專利技術涉及一種小分子肽及其應用。
技術介紹
免疫球蛋白IgG，即抗體是一種特殊的蛋白質(zhì)分子，被作為體外診斷的試劑、治療疾病的藥物、免疫親和層析的配基等，在生命科學研究、生物技術及醫(yī)學領域中有著廣泛的應用。目前，IgG的分離純化多采用抗體的天然親和配體ProteinA/G,由于ProteinA/G存在與抗體Fe片段專一性識別的能力，使用ProteinA/G親和色譜純化抗體，獲得的產(chǎn)品的純度較高。但是由于ProteinA/G也屬于具有活性的生物物質(zhì)，因此ProteinA/G分離也存在一些問題:I)價格昂貴:因為蛋白A配基需要通過基因工程的方法生產(chǎn)純化，因此生產(chǎn)成本高，其價格達到$10000/升親和介質(zhì)；2)缺乏有效的清洗方法，由于蛋白A在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定，因此不能使用一般的氫氧化鈉原位清洗法；3)由于配基也屬于蛋白質(zhì)，易被存在原料液中的蛋白酶水解，從而降低分離效果;4)與一般的化學配基相比，蛋白A色譜的使用生命周期較短；5)配基易脫落， 脫落的蛋白A會引起人的免疫反應且在臨床上已經(jīng)證實對人體有毒害;6)洗脫pH較低(pH2-3)，易引起一些抗體失活或者出現(xiàn)聚集，常常需要邊收集產(chǎn)品，邊中和，增加操作的復雜度。對于抗體的分離純化，也有很多研究者嘗試使用小分子化合物作為配體，也取得的了一定的效果，但是目前的小分子化合物配體也存在一些問題:I)生理毒性:目前的小分子化合物配體多含有雜環(huán)，具有一定毒性。例如，4-巰基-乙基吡啶(MEP)，其對小鼠50%致死量為178mg/kg。2)親和性差:目前的小分子化合物配體親和力通常較ProteinA/G低。所以，目前IgG的分離純化缺乏一種高效安全經(jīng)濟的親和配體。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的在于針對上述問題，提供了一種小分子親和肽作為親和配體，實現(xiàn)高效安全經(jīng)濟的IgG分離純化。本專利技術的另一目的是提供上述小分子親和肽的應用。本專利技術的小分子親和肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1-18中的任一項所示。進一步地，根據(jù)本專利技術的小分子親和肽，其結(jié)構(gòu)特征，自N端至C端如下:NH2-R1-R2-R3-R4-COOH,其中，R1為谷氨酸(Glu)或門冬氨酸(Asp)，R2和R3為色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe)，R4為半胱氨酸(Cys)。也可以理解為R1為酸性氨基酸，R2和R3為含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，R4為半胱氨酸(Cys)。本專利技術的小分子親和肽，所述小分子親和肽與人免疫球蛋白IgG的Fe片段結(jié)合。進一步的，本專利技術通過將所述的小分子肽偶聯(lián)于載體以分離純化免疫球蛋白IgG。本專利技術提供一種小分子親和肽及其應用，用于分離純化免疫球蛋白IgG，通過將所述的小分子肽偶聯(lián)于不同的載體可以實現(xiàn)不同條件下免疫球蛋白IgG的分離或純化，例如將該小分子肽偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠，可以制備親和層析柱純化免疫球蛋白IgG ;而將該小分子肽偶聯(lián)于透析器的中空纖維膜，則可應用于自身免疫性疾病的血液凈化治療，選擇性的清除致病IgG。本專利技術與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和有益效果:I)高效:該小分子親和肽的結(jié)合力與人免疫球蛋白天然配體ProteinA/G相當。2)安全:該小分子親和肽分子量小(小于6肽)，無免疫原性；其殘基序列取自20種必需氨基酸，安全無毒。3)經(jīng)濟:該小分子親和肽由固相合成而得，成本較低且便于質(zhì)量管控。因而采用該小分子親和肽作為親和配體，可以實現(xiàn)高效、安全、經(jīng)濟的IgG分離純化。附圖說明圖1為本專利技術中小分子親和肽I與免疫球蛋白IgG的SPR動力學測定曲線；圖2為天然配體與免疫球蛋白IgG的SPR動力學測定曲線。具體實施例方式實施例1多肽合成I)活化樹脂:稱取 IOOOmg FMOC Cys-wang Resin，加入 10_15mLDMF浸泡 30min(浸沒全部樹脂)，使其充分溶脹。2)脫保護:壓濾除去浸泡樹脂的DMF，加入用20%哌啶的DMF溶液10mL，氮氣吹沸反應15min，然后壓濾除去用20%哌啶的DMF溶液，脫除氨基的FMOC基團，用IOmL異丙醇洗滌樹脂三次，IOmL DMF洗三次，而后用茚三酮法檢測樹脂應成黑色或紫色。3)縮合反應:連接下一個氨基酸，稱取FMOC-氨基酸(Glu或Asp)的用量是1.4mmol/g 樹脂，910mg TBTU,加入 IOmL DMF 和 0.45g HOBt 混和均勻后，加入 0.52mL DIEA配成反應液，室溫下氮氣吹沸反應2h。反應完畢后，用異丙醇洗滌樹脂三次，然后用DMF洗滌樹脂三次。檢測氨基。4)重復步驟2)-3):按多肽的順序自C端向N端延伸多肽。重復脫保護、洗滌、縮合的過程至剩余的氨基酸連接完畢，完成多肽的連接。第二位與第三位氨基酸為Trp或Tyr或Phe，末位氨基酸為Cys。5)多肽切割:用氮氣將多 肽-樹脂復合物吹干，按TFA/phenol/H20/thioanisole/EDT/TIS (80/5/5/5/3/2)的比例配成混和切割試劑。將肽樹脂置于圓底燒瓶中，加入切割液磁力攪拌2小時，用200目砂芯過濾器除去樹脂，濾液直接抽入冷凍乙醚中，3000r / min離心使粗肽沉淀，凍干至恒重即得粗肽，干燥稱重。6)粗肽用HPLC純化至95%以上，質(zhì)譜鑒定。實施例2IgG親和特性測定I)配制 10mmol/L Hepes 緩沖液，ρΗ7.4，NaCl 含量 150mmol/L。2)以I)中配制液體為流動相，運行BiaCoreT200分析儀。3 )插入檢測芯片CM5，設定流速30 μ L/min。4)依次注入EDC和NHS各100 μ L，活化芯片。5)將IgG溶解于醋酸鈉緩沖液，ρΗ4.5，IgGlOO μ g/mL。6)注入5)中IgG溶液100 μ L，固定IgG于芯片表面。7)將小分子親和肽I (氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示)，小分子親和肽2 (氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示)，小分子親和肽3 (氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示)和天然配體(ProG與ProA),溶解于I)中配制液體,含量100 μ g/mL。8)依次注入不同濃度的多肽和天然配體，記錄其與IgG的吸附曲線。求得其相關參數(shù)，具體結(jié)果見圖1、圖2及其表I (小分子親和肽2、3的免疫球蛋白IgG的SPR動力學測定曲線圖的繪制同小分子親和肽1，本實施例不再累述給出)。表I為本專利技術中小分子親和肽，ProteinA/G與免疫球蛋白IgG結(jié)合常數(shù)比較表本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種小分子親和肽，其特征在于，所述小分子親和肽的氨基酸序列如SEQ?IDNo.1?18中的任一項所示。

【技術特征摘要】
1.一種小分子親和肽，其特征在于，所述小分子親和肽的氨基酸序列如SEQ IDN0.1-18中的任一項所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子親和肽，其特征在于，所述小分子親和肽與人免疫...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：徐霞，韋宇平，
申請(專利權(quán))人：中國科學院過程工程研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：