本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種具有促成骨生長(zhǎng)的生物活性多肽及其制備方法，氨基氨基序列滿足下列通式中的任意一種：Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2、Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-DGRGDSVAYG-CONH2和Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-G-PRGDSGYRGDS-CONH2；所述的多肽采用固相合成法合成。本發(fā)明專利技術(shù)可以讓營(yíng)養(yǎng)物資、生物活性分子和氧氣到達(dá)所種植的細(xì)胞，生物相容性良好，突破了來(lái)源的限制，成骨生長(zhǎng)肽能顯著促進(jìn)成骨分化和新生骨的形成。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及促成骨生長(zhǎng)的生物活性多肽，屬于生物技術(shù)多肽及醫(yī)用材料領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
再生醫(yī)學(xué)和組織工程需要兩個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)機(jī)體無(wú)毒、生物相容性良好的支架材料和能有效代替受傷組織而沒有副反應(yīng)的適宜細(xì)胞，包括各種干細(xì)胞和祖原細(xì)胞。因此，選擇適當(dāng)而有效的生物活性支架來(lái)刺激和促進(jìn)細(xì)胞分化，支持組織再生是組織工程的關(guān)鍵問題。1992年，美國(guó)麻省理工學(xué)院的張曙光偶然從酵母蛋白中發(fā)現(xiàn)了能自組裝的離子短肽，該離子短肽是由8 16個(gè)氨基酸構(gòu)成的自組裝體系，可作為細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。與其他生物醫(yī)學(xué)材料相比，自組裝多肽孔徑約5-500nm，這樣的纖維網(wǎng)狀支架材料類似于細(xì)胞外基質(zhì)，有利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)；自組裝多肽材料形成的水凝膠含水量大于99%，表面積非常 大，可以讓營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生物活性分子和氧氣到達(dá)所種植的細(xì)胞；自組裝多肽材料成分簡(jiǎn)單，生物相容性良好，因其在體內(nèi)的降解產(chǎn)物為氨基酸，可被生物體吸收或代謝而無(wú)毒副作用。多肽分子自組裝技術(shù)在為生物醫(yī)學(xué)材料及其它領(lǐng)域顯示出巨大的潛力，研究多肽自組裝有助于更好的研究生命現(xiàn)象，并在微觀分子水平設(shè)計(jì)新材料。通過改變氨基酸排列順序可設(shè)計(jì)合成具有不同結(jié)構(gòu)的分子自組裝體，以發(fā)揮支架材料最好的功能特性。離子型多肽具有性質(zhì)截然不同的兩個(gè)表面，一個(gè)親水面,一個(gè)疏水面,它們交替排列，像積木塊的楔和孔一樣，代表性的多肽如EAK16和RADA16等。疏水性氨基酸Gly可由Leu、Ile、Ala、Val或Tyr替代，以增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度，更適應(yīng)某種特定的硬性組織工程或組織修復(fù)，如骨組織工程。成骨生長(zhǎng)肽(ALKRQGRTLYGF)是骨組織修復(fù)中成骨生長(zhǎng)的一個(gè)關(guān)鍵因素。生理狀態(tài)下成骨生長(zhǎng)肽(OGP)主要以結(jié)合形式，即OGP-OGP結(jié)合蛋白(OGPBP)復(fù)合物的形式大量存在于人和哺乳動(dòng)物的血清中。體外實(shí)驗(yàn)中，成骨生長(zhǎng)肽能顯著促進(jìn)新生骨形成，明顯增加成骨活性蛋白堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(BGP)的濃度水平，當(dāng)應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，成骨生長(zhǎng)肽刺激骨生成和血細(xì)胞生成。1979年Senger等首次報(bào)道與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)的一種包含RGD整合素結(jié)合區(qū)的磷酸化糖蛋白與腫瘤的關(guān)系，稱之為轉(zhuǎn)化相關(guān)性磷酸蛋白，后將其命名為骨橋蛋白OPN。OPN是由前成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞合成的，分泌到前骨質(zhì)中形成骨。成骨細(xì)胞可合成44kDa的高磷酸化蛋白，能調(diào)節(jié)羥基磷灰石晶體生長(zhǎng)，因此，OPN被認(rèn)為是成骨細(xì)胞成熟分化的標(biāo)志。其相對(duì)分子質(zhì)量約為44kDa，約含300個(gè)氨基酸殘基，其中Arg-Gly-Asp (RGD)占有很高的比例。OPN通過依賴RGD序列(ανβ1、ανβ3、ανβ5、ανβ1、α8β1)和非依賴RGD序列(α4β1、α 9 β I)結(jié)合存在于細(xì)胞表面上的多種整合素受體，起細(xì)胞粘附作用。目前使用的人工合成的ECM替代物大多為聚合物(polymer)。聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)是最常用的兩種支架材料。近來(lái)聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物(PLGA)得到了深入的研究。具生物活性的玻璃陶瓷、羥基磷灰石(HAP)、鈣磷陶瓷，即羥基磷灰石和磷酸三鈣(HA/TCP)也可用于骨組織工程。公開號(hào)為CN101496911A的中國(guó)專利公開了一種在脫鈣骨基質(zhì)上交聯(lián)肝素所得的骨支架材料，由于其是由哺乳動(dòng)物的骨經(jīng)脫鈣再交聯(lián)而得，所以來(lái)源有限，且受其生物相容性的限制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供連接生物活性多肽的具有促進(jìn)骨生長(zhǎng)活性的新型結(jié)構(gòu)多肽，微觀方面，該類多肽的氨基酸殘基間通過非共價(jià)鍵相互作用自發(fā)組合形成的一類結(jié)構(gòu)明確，構(gòu)造穩(wěn)定的分子聚集體或超分子結(jié)構(gòu)。宏觀方面，該類多肽溶于總鹽離子(含Na、K、Ca、Mg和Cl)濃度彡ImM的水溶液時(shí)形成含水量大于99%的水凝膠，可應(yīng)用于組織工程。本專利技術(shù)解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是三種合成多肽中的任意一種，其氨·基氨基序列分別滿足通式Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2 ； Ac- (X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3) n_GG_DGRGDSVAYG-CONH2 ；Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-G-PRGDSGYRGDS-CONH2 ；其中，Ac為乙酰化N端，X1為L(zhǎng)-氨基酸，氨基類型為疏水性氨基酸Leu (亮)、Ile (異亮)、Ala (丙)、Gly(甘)或Val (纈)；X2 SL-氨基酸，氨基類型為帶負(fù)電荷的酸性氨基酸Asp (天冬)或Glu (谷)；X3為L(zhǎng)-氨基酸，氨基類型為帶正電荷的堿性氨基酸Lys (賴)、Arg (精)或His(組)；X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3為重復(fù)序列，η為氨基酸重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)，η=1或2 ;(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n重復(fù)序列的C端連接I或2個(gè)Gly，防止后續(xù)連接的生物活性肽影響重復(fù)序列的自組裝；在Gly的C端連接三種不同的生物活性肽成骨生長(zhǎng)肽、細(xì)胞粘附因子和含兩個(gè)DGR氨基序列的PRG，氨基序列分別為ALKRQGRTLYGF、DGRGDSVAYG和PRGDSGYRGDS。本專利技術(shù)提供上述多肽的合成方法，合成的多肽可以采用固相合成法合成，包括但不限于Fmoc-SPPS方式、BOC-SPPS方式、片段縮合連接方式。采用Fmoc-SPPS方式固相合成技術(shù)合成上述三種多肽包括以下步驟樹脂采用Fmoc-Amide-Wang Resin,置于反應(yīng)柱,加入無(wú)水二氯甲燒浸沒樹脂，浸泡溶脹30min后抽干，二甲基甲酰胺溶液洗滌。用質(zhì)量百分比為20%的六氫吡啶/二甲基甲酰胺溶液作為脫帽液，脫除氨基的Fmoc保護(hù)基，采用多肽合成儀或者手工合成多肽的方式，由C端向N端分步偶聯(lián)專利技術(shù)通式所述的所有氨基序列，采用I. 5倍樹脂摩爾量的HOBT或TBTU活化氨基酸的羧基，I. 5-3倍樹脂摩爾量DIC (N, N- 二異丙基碳二亞胺)作為反應(yīng)催化劑。稱取Fmoc-氨基酸-0H，TBTU或TBTU，六氫吡啶(摩爾量比=1 I. 5 I)溶于等摩爾量20%DMF的混合液中，加入I. 5-3倍樹脂摩爾量DIC催化反應(yīng)進(jìn)行。依次連接Fmoc-氨基酸-0H，使用Kaiser方法檢測(cè)每步是否連接完全，直至氨基序列全部完成。在最后一個(gè)Fmoc-氨基酸-OH脫保護(hù)后，加入I. 2-2倍樹脂摩爾量的乙酸酐吡啶二甲基甲酰胺=2:1:3(V:V)的混合溶液，搖蕩30分鐘，對(duì)裸露的氨基進(jìn)行乙酰化保護(hù)，成為多肽樹脂。甲醇洗滌3次，把樹脂抽干，由于含Tyr，易產(chǎn)生副反應(yīng)，采用10-15mL/g樹脂的TFA混合液(體積百分比為95:1:2:2的TFA、TIS、EDT和H2O)切割2_4小時(shí)。導(dǎo)入3_6倍混合液體積的冰乙醚進(jìn)行沉淀，離心2_4次收集沉淀，真空干燥24小時(shí)。固體殘留物用離子水溶解，冷凍干燥得到白色絮狀固體即粗品，-20°C保存。經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)分離純化收集主峰，色譜柱SpheriSOrb3-C18，粒徑 5 μ m，孔徑300 A,流動(dòng)相A，O. 1%TFA/H20 ；B, 0. 1%TFA/ACN,洗脫梯度，10%B—65%B。冷凍干燥得到純度95%以上的多肽粉末。本專利技術(shù)還將上述多肽進(jìn)行自組裝獲得水凝膠，可用于細(xì)胞培養(yǎng)，有望用于組本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種具有促成骨生長(zhǎng)的生物活性多肽，其特征在于：氨基氨基序列滿足下列通式中的任意一種：Ac?(X1?X2?X1?X2?X1?X3?X1?X3)n?GG?ALKRQGRTLYGF?CONH2；Ac?(X1?X2?X1?X2?X1?X3?X1?X3)n?GG?DGRGDSVAYG?CONH2；Ac?(X1?X2?X1?X2?X1?X3?X1?X3)n?G?PRGDSGYRGDS?CONH2；其中，Ac為乙酰化N端，X1為L(zhǎng)?氨基酸，氨基類型為疏水性氨基酸：Leu、Ile、Ala、Gly或Val；X2為L(zhǎng)?氨基酸，氨基類型為帶負(fù)電荷的酸性氨基酸：Asp或Glu；X3為L(zhǎng)?氨基酸，氨基類型為帶正電荷的堿性氨基酸：Lys、Arg或His；X1?X2?X1?X2?X1?X3?X1?X3為重復(fù)序列，n為氨基酸重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)，n=1或2；(X1?X2?X1?X2?X1?X3?X1?X3)n重復(fù)序列的C端連接1或2個(gè)Gly；在Gly的C端連接三種不同的生物活性肽成骨生長(zhǎng)肽、細(xì)胞粘附因子和含兩個(gè)DGR氨基序列的PRG，氨基序列分別為ALKRQGRTLYGF、DGRGDSVAYG和PRGDSGYRGDS。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：盧婷利，陳婷，馬玉樊，校月紅，李昱輝，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：西北工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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