用于檢測亞銅離子的熒光傳感器蛋白、質(zhì)?；蚣毎?、編碼該蛋白的DNA及制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及用于檢測亞銅離子的熒光傳感器蛋白，檢測時信號變化明顯，同時可減少鋅離子對亞銅離子檢測的干擾。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及表達上述熒光傳感器蛋白的質(zhì)?；蚣毎?，以及編碼上述熒光傳感器蛋白的DNA及其制備方法。所述用于檢測亞銅離子的熒光傳感器蛋白，在增強綠色熒光蛋白內(nèi)插入對亞銅離子響應(yīng)的蛋白域，得到所述熒光傳感器蛋白，使得在單一時間所述熒光傳感器蛋白中的熒光蛋白和亞銅離子結(jié)合蛋白只有一個能夠正確折疊。實驗結(jié)果表明，該傳感器蛋白能夠在較低亞銅離子濃度時(＜1微摩)就有熒光響應(yīng)，熒光強度的變化在50％以上，同時較好地克服了鋅離子的干擾，對其他常見離子均無響應(yīng)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種用于檢測亞銅離子的熒光傳感器蛋白、質(zhì)粒或細胞、編碼該蛋白的DNA及制備方法。
技術(shù)介紹
作為多種有著催化功能的蛋白的輔助因子，亞銅離子對在整個生命過程中起到很大的作用。然而過量的亞銅離子卻會與其他的金屬結(jié)合蛋白發(fā)生誤結(jié)合，同時自由的亞銅離子也可以催化一些反應(yīng)，產(chǎn)生反應(yīng)活性很高的氧自由基。如果體內(nèi)的亞銅離子不能夠很好的調(diào)控，會引發(fā)一些致命的疾病，如Wilson病和Menkes卷發(fā)綜合征等。因而檢測體內(nèi)的亞銅離子非常重要。構(gòu)造可用于體內(nèi)亞銅離子檢測的傳感器的主要技術(shù)難點主要在以下幾個方面1、探測器必須有較好的生物相容性和低毒性；2、探測器必須比較容易進入體內(nèi)；3、探測器的信噪比較高，較容易地進行檢測；4、檢測專一性強，不受其他金屬離子的干擾。而目前已有的兩類方法，化學(xué)標(biāo)記法和熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)。它們在上述4個方面或多或少都有著不可彌補的缺陷?；瘜W(xué)方法的缺點是較低的生物相容性和其潛在的毒性。所以一直沒有有效的應(yīng)用到體內(nèi)。熒光能量共振轉(zhuǎn)移的方法基于熒光蛋白和能夠結(jié)合亞銅離子的蛋白域。這種傳感器能夠直接在細胞內(nèi)表達，因而可以克服上述I和2兩項技術(shù)難點，但在3和4兩方面還存在不足。目前僅有的一種報道的FRET傳感器，它將青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白用一段亞銅離子結(jié)合蛋白連接起來，構(gòu)成一個復(fù)合蛋白質(zhì)。通過兩種熒光蛋白的FRET信號來表征中間段蛋白在結(jié)合亞銅離子前后的構(gòu)象變化。但目前該方法的信號還是會受到鋅離子的微弱干擾，并且整體上信號在結(jié)合前后的變化幅度很小(低于10% )，需要復(fù)雜的信號處理。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供一種用于檢測亞銅離子的熒光傳感器蛋白，檢測時信號變化明顯，同時可減少鋅離子對亞銅離子檢測的干擾。本專利技術(shù)還提供表達上述熒光傳感器蛋白的質(zhì)粒或細胞，可以用于檢測亞銅離子。本專利技術(shù)還提供編碼上述熒光傳感器蛋白的DNA及其制備方法。所述用于檢測亞銅離子的熒光傳感器蛋白，在增強綠色熒光蛋白內(nèi)插入對亞銅離子響應(yīng)的蛋白域，得到所述熒光傳感器蛋白，使得在單一時間所述熒光傳感器蛋白中的熒光蛋白和亞銅離子結(jié)合蛋白只有一個能夠正確折疊。作為優(yōu)選方案，在增強綠色熒光蛋白(以下簡稱EGFP)中的第6個和第7個beta片間的環(huán)狀區(qū)域插入亞銅離子結(jié)合蛋白Amtl，得到所述熒光傳感器蛋白。所述熒光傳感器蛋白的序列為MVSKGEELFTGVVPILVELD⑶VNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNIgRGRPPTTCDHCKDMRKTKNVNPSGSCNCSKLEKIRQEKGITIEEDMLMSGNMDMCLCVRGEPCRCHARRKRTQKSIgYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。 編碼所述熒光傳感器蛋白的DNA。所述DNA的序列為ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACCTCGGGCGTGGTCGTCCGCCGACCACCTGCGACCACTGCAAAGACATGCGTAAAACCAAAAACGTTAACCCGTCTGGTTCTTGCAACTGCTCTAAACTGGAAAAAATCCGTCAGGAAAAAGGTATCACCATCGAAGAAGACATGCTGATGTCTGGTAACATGGACATGTGCCTGTGCGTTCGTGGTGAACCGTGCCGTTGCCACGCTCGTCGTAAACGTACCCAGAAATCTCTCGGGTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG。所述DNA的制備方法為，將限制性內(nèi)切酶aval酶切位點特異性的引入綠色熒光蛋白EGFP中連接第6個和第7個beta片中間的環(huán)形區(qū)域,再用Aval去酶切,純化出線性部分后與兩端有Aval黏性末端的Amtl DNA做連接反應(yīng)，即可得到編碼熒光傳感器蛋白的DNA。具體的步驟優(yōu)選為所述綠色熒光蛋白基因在pUC19質(zhì)粒的BamHl和Kpnl多克隆位點中，分別用引物 5 ’ CCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACCTCGGGTACAACAGCCACAACGTCTATATC3’ 和 5’ GATATAGACGTTGTGGCTGTTGTACCCGAGGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGG3’ 進行突變PCR反應(yīng)，將限制性內(nèi)切酶aval酶切位點特異性的引人綠色熒光蛋白中連接第6個和第7個beta片中間的環(huán)形區(qū)域,得到質(zhì)粒pUC19_GFPAvalin,再進行Aval酶切,純化出線性的pUC19-GFPAvalin后與兩端有Aval黏性末端的Amtl DNA做連接反應(yīng)，即可得到處于克隆質(zhì)粒pUC19的BamHl和Kpnl位點當(dāng)中的編碼熒光傳感器蛋白的DNA。表達所述熒光傳感器蛋白的表達質(zhì)?；蚣毎?。本專利技術(shù)通過將一個亞銅離子結(jié)合蛋白特異性的放到一個單一的熒光蛋白內(nèi)部，構(gòu)建出一個傳感器蛋白。熒光蛋白被亞銅離子結(jié)合蛋白在序列上被一分為二，當(dāng)沒有亞銅離子存在的時候，亞銅離子結(jié)合蛋白處于無規(guī)卷曲狀態(tài)，熒光蛋白能夠很好的折疊，發(fā)出熒光。但當(dāng)亞銅離子存在的時候，中間插入的蛋白變得有序，它的折疊會引起熒光蛋白的解折疊，從而引發(fā)熒光的淬滅。在單一時間熒光蛋白和亞銅離子結(jié)合蛋白只有一個能夠正確折疊，相當(dāng)于這個復(fù)合蛋白的兩個部分的折疊是互相具有排斥性的，即所述熒本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種用于檢測亞銅離子的熒光傳感器蛋白，其特征在于，在增強綠色熒光蛋白內(nèi)插入對亞銅離子響應(yīng)的蛋白域，得到所述熒光傳感器蛋白，使得在單一時間所述熒光傳感器蛋白中的熒光蛋白和亞銅離子結(jié)合蛋白只有一個能夠正確折疊。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王煒，梁俊毅，秦猛，曹毅，
申請(專利權(quán))人：南京大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：