方法技術

本發明專利技術涉及修飾包含至少兩個賴氨酸殘基的多肽中特定的賴氨酸殘基的方法，所述方法包括：(a)提供包含受第一保護基團保護的目標賴氨酸和至少一個另外的賴氨酸殘基的多肽；(b)處理所述多肽以保護所述另外的賴氨酸殘基，其中，所述另外的賴氨酸殘基的保護基團與目標賴氨酸殘基的保護基團不同；(c)選擇性地去保護目標賴氨酸殘基；和(d)修飾(c)中去保護了的賴氨酸殘基。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】技 術領域本專利技術涉及蛋白質的合成和修飾。具體地，本專利技術涉及賴氨酸連接的蛋白質的修飾。
技術介紹
賴氨酸殘基是蛋白質翻譯后修飾的關鍵決定因素，它們在主要的翻譯后修飾如泛素化、甲基化和乙酰化中的作用已為人熟知。然而，選擇性地修飾蛋白質中的特定賴氨酸殘基仍是一個問題。泛素化是一個可逆的翻譯后修飾，在該過程中受體蛋白中的特定賴氨酸殘基與泛素供體的C-末端形成異肽鍵。雖然泛素化通過蛋白酶體靶向來調節蛋白質穩定性的作用是公認的，但目前顯示泛素參與生物學的幾乎每一個方面，包括細胞信號轉導、細胞內轉運和對DNA損傷的應答W。泛素通過它的每個賴氨酸殘基(K6、K11、K27、K29、K33、K48或K63)或通過N-末端形成共價鏈，并且認為泛素在不同的生物過程中介導的不同功能可能被編碼在不同泛素鏈的不同性質中2’3。雖然蛋白質組學研究揭示體內存在所有的鏈類型4’5，但所知的多數均與K48鏈和K63鏈有關，這兩個鏈分別在蛋白酶體降解和細胞信號傳導中起重要作用w。相比之下，對其他所謂的“非典型”連接(linkage)知之甚少，而這些“非典型”連接則占在蛋白質組學數據已知的模式生物中發現的泛素連接的一半以上5。研究具體泛素鏈的作用的關鍵難題在于合成具有所定義的連接的均質鏈。本專利技術旨在克服與現有技術相關的問題。專利技術概述本專利技術人已經解決了特異靶向多肽鏈內用于修飾的單個賴氨酸殘基的問題，其中一方面是在基因工程上編碼用于目標賴氨酸的化學保護。這能夠實現多肽鏈內特定殘基的位點特異性保護。更重要的是，本專利技術人開發了用于差異保護多肽中的賴氨酸的技術。具體而言，本專利技術人教導了不同于基因工程編碼的保護的化學保護的使用。通過這種方式，產生的多肽可具有受通過目標賴氨酸的基因工程編碼保護的位點特異性保護的所述目標賴氨酸。然后，這種具有受位點特異性保護的賴氨酸的多肽可以進行化學處理以保護每個剩余的(未被保護的)具有不同化學保護基團的賴氨酸殘基。這種雙重具有的優點是形成的多肽在其賴氨酸上具有兩種不同類型的化學保護。這能夠使原始的目標賴氨酸通過化學被選擇性地去保護，同時使其他賴氨酸上的其他保護基團保持完整。通過這種方式，目標賴氨酸被位點特異地的去保護并因此可以被修飾，而其他賴氨酸則不受影響。最后，根據需要所有未被修飾的賴氨酸都可以被任選地去保護以留下與天然相同的賴氨酸殘基。本專利技術是基于選擇性的保護/去保護多肽序列中的目標賴氨酸的創造性的差異化學。因此，一方面，本專利技術提供了修飾包含至少兩個賴氨酸殘基的多肽中的特定賴氨酸殘基的，所述包括(a)提供包含受第一保護基團保護的目標賴氨酸殘基和至少一個另外的賴氨酸殘基的多妝；(b)處理所述多肽以保護所述另外的賴氨酸殘基，其中所述另外的賴氨酸殘基的保護基團不同于所述目標賴氨酸殘基的保護基團；(C)選擇性地去保護目標賴氨酸殘基；和 (d)修飾(C)的所述去保護了的賴氨酸殘基。合適地，所述多肽的產生包括(i)提供編碼所述多肽的核酸，所述核酸包含編碼所述目標賴氨酸的正交密碼子;(ii)在正交tRNA合成酶/tRNA對存在下翻譯所述核酸，其中所述正交tRNA合成酶/tRNA對能夠識別所述正交密碼子并向所述多肽鏈中引入受第一保護基團保護的所述目標賴氨酸殘基。合適地，所述正交密碼子包括TAG，所述tRNA包括MbtRNAatt,所述tRNA合成酶包括 MbPyIRS。合適地，由第一保護基團保護的所述目標賴氨酸殘基選自由N ε -(叔丁氧基羰基)-L-賴氨酸組成的組。合適地，由第一保護基團保護的所述目標賴氨酸殘基是N ε_(叔丁氧基羰基)-L-賴氨酸。合適地，所述另外的賴氨酸殘基的保護基團選自N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)。當所述另外的賴氨酸殘基的保護基團是N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)時，合適地，它在堿性DMSO中提供。合適地，所述另外的賴氨酸殘基的保護基團是N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)。合適地，步驟(b)包括用含N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)的堿性DMSO處理所述多肽。合適地，所用的Cbz-Osu的量計算為乘以。有利地，這提供了用于與待保護的賴氨酸反應的略過量的保護基團，并由此有助于推動反應完全(飽和度/均勻性)。合適地，步驟(C)包括用含三氟乙酸(TFA)的水處理所述多肽。合適地，步驟(d)的修飾包括(i)通過在Ag (I)存在下轉換成N-羥基琥珀酰亞胺酯而活化硫酯；(ii)將待連接的多肽加入至所述目標賴氨酸；和(iii)溫育以形成特異的異肽鍵。合適地，步驟(d)的修飾在目標賴氨酸殘基的ε -氨基基團上進行。合適地，在步驟(d)中可對目標賴氨酸進行多個修飾。合適地，如上所述的另外包括步驟(e):使所述另外的賴氨酸殘基去保護。合適地，步驟(e)包括用比例為1:3:6的三氟甲磺酸(TFMSA):三氟乙酸(TFA) : 二甲基硫醚(DMS)的混合物處理所述多肽。修飾完成后去保護所有剩余的賴氨酸的好處之一是將所述多肽恢復至與其天然形式盡可能接近。合適地，步驟(a)包括通過在所述多肽的翻譯過程中從基因工程學上向所述多肽鏈中引入受第一保護基團保護的所述目標賴氨酸殘基而產生所述多肽。合適地，所述多肽是泛素。合適地，步驟(d)的修飾是另外的多肽鏈與所述目標賴氨酸的共價連接。合適地，所述另外的多肽鏈是泛素。在該實施方式中，本專利技術可有利地應用于多肽的泛素化。在一些實施方式中，所述多肽是泛素，所述另外的多肽鏈是泛素。在這些實施方式中，本專利技術可有利地應用于泛素鏈的生產。這些鏈可以簡單地通過在第一多肽中選擇適當·的賴氨酸殘基進行靶向而以泛素的任何K-連接形式(如K6、K11、K27、K29、K33、K48或Κ63連接的泛素)產生。在進行多個修飾時，可重復步驟(c)-(d)以產生由通過賴氨酸殘基的共價連接而連接的多肽鏈。顯然，這可能包括在每輪修飾結束時且在按修飾順序的下一反應進行前的重復去保護。或者，如果用于后續修飾的反應化學已經特異于來自前(幾)輪修飾的目標賴氨酸(或經修飾的目標賴氨酸)，則后續的修飾可能不需要保護/去保護。本專利技術還提供了根據上述產生的多肽。所述多肽可包括K-連接的泛素鏈。所述K-連接可以是Κ6、Κ11、Κ27、Κ29、Κ33、Κ48或Κ63連接。合適地，所述K-連接是Κ6或Κ29連接。另一方面，本專利技術涉及TRABID作為Κ29去泛素化酶的應用。另一方面，本專利技術涉及切割Κ29連接的泛素的，所述包括使Κ29連接的泛素與TRABID接觸。另一方面，本專利技術涉及包含至少一個受保護的賴氨酸殘基的泛素多肽。泛素多肽包含一個或多個K6Boc、K29Boc。另一方面，本專利技術涉及編碼泛素的核酸，其中在所述泛素中至少一個賴氨酸密碼子被正交密碼子替代。另一方面，本專利技術涉及本專利技術的K-連接泛素用于例如活化或增強對DNA損傷的響應，和/或用于預防或治療諸如早發型乳腺癌或卵巢癌的癌癥中的應用。這些應用可有利地用于藥物中。本專利技術優選的也可在以下說明書中稱為G0PAL(基因工程上編碼的正交保護和活性連接)。合適地，本專利技術中的靶向反應用于將蛋白質連接在一起。在本專利技術的另一方面，提供了可從所述獲得的蛋白質。合適地，所述蛋白質是泛素。在本專利技術的另一方面，提供了均勻連接的泛素鏈，其中本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：賈森·欽，維·P·阮，薩特帕爾·維爾德，
申請(專利權)人：醫藥研究委員會，
類型：
國別省市：