一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，特點(diǎn)是包括10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、濃度為100mM的MgSO4溶液、濃度為10mM的dNTP液、濃度為5M的甜菜堿溶液、濃度為8U/μL的BstDNA聚合酶液、FIP/BIP引物溶液、F3/B3引物溶液和雙蒸水，F(xiàn)IP引物序列如SEQIDNO.1所示，BIP引物序列如SEQIDNO.2所示，F(xiàn)3引物如SEQIDNO.3所示，B3引物序列如SEQIDNO.4所示，優(yōu)點(diǎn)是具有高靈敏度、高特異性，適用于海水養(yǎng)殖場(chǎng)中大黃魚香魚假單胞菌病的快速檢測(cè)。?

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及香魚假單胞菌的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
香魚假單胞菌最初由患出血癥香魚內(nèi)臟分離，近年發(fā)現(xiàn)在浙江、福建能引起大黃魚內(nèi)臟肉芽腫疾病。該致病菌可引起大黃魚活動(dòng)異常、內(nèi)臟肉芽腫，組織壞死等癥狀。如2010年3月和11月寧波象山爆發(fā)了大規(guī)模的大黃魚香魚假單胞菌病，疫情涵蓋各種規(guī)格大黃魚，同時(shí)致病菌可通過親魚傳遞至下一代幼魚中潛伏，大黃魚的死亡率達(dá)60%以上，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此預(yù)先分析、檢測(cè)確定發(fā)病菌種就顯得尤為重要。目前檢測(cè)香魚假單胞菌感染的方法主要包括生理生化檢測(cè)、組織病理學(xué)觀察、顯微鏡檢以及PCR等生物技術(shù)診斷方法。但是這些傳統(tǒng)檢測(cè)方法不能夠區(qū)分香魚假單胞菌與假單胞菌屬中的其他細(xì)菌，如惡臭假單胞菌等，缺乏靈敏度和特異性。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)具有極高的靈敏度和特異性，已被廣泛應(yīng)用于致病菌的診斷實(shí)踐，但其需要PCR儀等諸多精密儀器的配套使用，使其無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)和基層檢驗(yàn)的需要。為有效控制大黃魚香魚假單胞菌病，需建立靈敏、特異、高效和簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，該LAMP檢測(cè)試劑盒具有高靈敏度、高特異性、適用于海水養(yǎng)殖場(chǎng)中大黃魚香魚假單胞菌病的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；應(yīng)用該LAMP檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)大黃魚細(xì)菌感染的方法具有操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器要求簡(jiǎn)單，結(jié)果易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，為香魚假單胞菌病的早期防治提供技術(shù)支持。本專利技術(shù)解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、濃度為IOOmM的MgSO4溶液、濃度為10mM的dNTP液、濃度為5M的甜菜堿溶液、濃度為8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / Β3引物溶液和雙蒸水，所述FIP / BIP引物溶液含有FIP引物和BIP引物，所述FIP 引物的核苷酸序列為GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGT，所述BIP 引物的核苷酸序列為TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG，所述FIP引物和所述BIP引物的濃度都為I. 6 2. 4 μ M，所述F3 / Β3引物溶液含有F3弓丨物和Β3引物，所述F3引物的核苷酸序列為TCTGTTCATGCCGATCAAGC，所述Β3引物的核苷酸序列為GCAGCTGCCCACTTGGT，所述F3引物和B3引物的濃度都為O. 4 O. 6 μ M。所述的LAMP檢測(cè)試劑盒的100 X 25 μ L反應(yīng)體系配制方法如下10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液250 μ L、濃度為IOOmM的MgSO4溶液50 μ L、濃度為10 mM的dNTP液300 μ L、濃度為8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液100 μ L、濃度為5Μ的Betaine溶液400 μ L、引物濃度都為1.6 2.4y]\^3FIP / BIP引物溶液50 μ L、濃度都為O. 4 O. 6 μ M的F3 / Β3引物溶液50 μ L，余量用雙蒸水補(bǔ)足。所述的ThermoPol反應(yīng)緩沖液的終濃度配制方法如下200mMTris-Hcl, 100 mMKCl, 20 mM MgSO4,100 mM (NH4)2SO4,1. 0% TritonX-100，ρΗ8· 8。所述的LAMP檢測(cè)試劑盒還包括有陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液，所述的陽(yáng)性對(duì)照液含有香魚假單胞菌陽(yáng)性DNA，所述的陰性對(duì)照液為雙蒸水。一種利用魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大黃魚香魚假單胞菌病的方法，包括下述步驟 (O取被感染大黃魚黃豆大小內(nèi)臟組織一塊，加入450 1的TE緩沖液，同時(shí)用醫(yī)用剪刀剪碎組織，室溫6000r/min洗滌離心2min，倒掉上清液，取沉淀物再加入所述TE緩沖液450 μ 1，濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液3 μ 1，質(zhì)量百分濃度為20%的十二烷基硫酸鈉溶液20 μ I，混勻，于37°C首次溫浴30min，首次溫浴結(jié)束，加入濃度為5mol/L的NaCl溶液100 μ 1，溴化十六烷三甲基銨氯化鈉混合液80 μ 1，混勻，于65°C再次溫浴lOmin，得到菌體溫浴液； (2)在步驟(I)得到的菌體溫浴液中加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混勻，12000r/min離心5min,取上清液,所述氯仿異戍醇混合液中氯仿與異戍醇體積比為24:1 ； (3)在步驟(2)得到的上清液中加入等體積的酚氯仿異戊醇混合液混勻，12000r/min離心5min，取上清液再次加入等體積的所述酚氯仿異戊醇混合液混勻，12000r/min離心5min，如此重復(fù)混勻、離心至無(wú)白色物質(zhì)為止，得到去雜上清，所述酚氯仿異戊醇混合液中酚、氯仿與異戊醇的體積比為25:24:1 ； (4)在步驟(3)得到的去雜上清中加入所述去雜上清兩倍體積的無(wú)水乙醇，室溫放置8 12min，然后在4°C，14000r/min離心20min，棄上清，沉淀用質(zhì)量百分濃度為70%的乙醇洗滌兩次，然后在空氣中晾曬5 20min，再加入所述TE緩沖液20 μ 1，_20°C保存，得到樣品DNA模板； (5)取樣品DNA模板Iμ 1，與所述魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒組成25 μ L反應(yīng)體系10 X ThermPol緩沖液2. 5 μ L，dNTP溶液2. O μ L，Bst DNA聚合酶液l.OyL, MgSO4 溶液 O. 5 μ L，Betaine 溶液 4. O μ L, FIP / BIP 引物溶液 O. 5 μ L，F(xiàn)3 / Β3引物溶液O. 5μ L，樣品DNA模板I μ 1，余量用雙蒸水補(bǔ)足；60 65°C下反應(yīng)，反應(yīng)完畢，出現(xiàn)肉眼可見白色沉淀或反應(yīng)液渾濁則該菌體為香魚假單胞菌；或反應(yīng)完畢取4. Ομ I的反應(yīng)液，用經(jīng)溴化乙錠(EB)染色后的I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下分析擴(kuò)增結(jié)果，顯示階梯狀的特異性條帶為陽(yáng)性，無(wú)條帶為陰性。所述的TE緩沖液的pH 8. O,Tris-HCl濃度10mmol/L,乙二胺四乙酸濃度Immol/L0所述的溴化十六烷三甲基銨氯化鈉混合液中溴化十六烷三甲基銨的質(zhì)量百分濃度為10%, NaCl的濃度為O. 7mol/L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，包括反應(yīng)緩沖液、MgSO4溶液、dNTP液、Bst DNA聚合酶液、Betaine溶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / B3引物溶液和雙蒸水，F(xiàn)IP引物的核苷酸序列為GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGT, BIP 引物的核苷酸序列為 TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG, F3引物的核苷酸序列為AAGTGCAAGT CATCAGCT, B3引物的核苷酸序列為GCAGCTGCCCACTTGGT ;該LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)魚類致病菌香魚假單胞菌具有高靈敏度、高特異性，適用于海水養(yǎng)殖場(chǎng)中大黃魚香魚假單胞菌病的快速檢測(cè)；用該LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)魚類致病菌香魚假單胞本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種魚類致病菌香魚假單胞菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括10×ThermoPol?反應(yīng)緩沖液、濃度為100mM的MgSO4溶液、濃度為10?mM的dNTP液、濃度為5M的甜菜堿溶液、濃度為8?U?/μL?的Bst?DNA?聚合酶液、FIP?/?BIP引物溶液、F3?/?B3引物溶液和雙蒸水，所述FIP?/?BIP引物溶液含有FIP引物和BIP引物，所述FIP引物的核苷酸序列為：GCGTTCTTGCTGGCGCAGGTCGATGTACTGGTCGAGCGT，?所述BIP引物的核苷酸序列為：TGCCGCGTGCCGACTTTTGGCCAGGTCACCGG，?所述FIP引物和所述BIP引物的濃度都為1.6～2.4μM，所述F3?/?B3引物溶液含有F3引物和B3引物，所述F3引物的核苷酸序列為：TCTGTTCATGCCGATCAAGC，所述B3引物的核苷酸序列為：GCAGCTGCCCACTTGGT，?所述F3引物和B3引物的濃度都為0.4～0.6μM。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王國(guó)良，張繼挺，周濤，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：寧波大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：