解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，屬于微孔反應板的檢測技術。本發明專利技術是在包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板微孔內，分別加入經PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本，另外設立分別加入Uu、Up血清型標準株PCR擴增后熱變性處理的陽性對照孔；經溫箱雜交后洗板，拍干；每孔加入鏈親和素辣根過氧化物酶結合物，后經洗板，晾干；每孔加入顯色底物A、B，混勻后暗處顯色，最后加入終止液，以顏色變化判斷結果。本發明專利技術不僅解決了以液體培養基顏色改變判斷陽性結果出現假陽性的問題，還能準確地進行Uu和Up的鑒別，提高了檢測的敏感度，同時也實現了高通量的檢測，可廣泛用于臨床篩查。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微孔反應板的檢測技術，具體是一種解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum, Uu)和微小脲原體(Ureaplasma parvum, Up)的檢測方法。
技術介紹
支原體(Mycoplasma)是一類介于細菌和病毒之間，沒有細胞壁，能通過細菌濾器，能在人工培養基上生長繁殖的最小原核生物 。支原體歸屬于柔膜體綱，支原體目，支原體科。支原體科分為支原體，血蟲體，血巴爾通體和脲原體4個屬。其中，多項研究證明脲原體屬的解脲脲原體與女性泌尿生殖道的非淋菌性尿道炎、流產、早產、低體重兒等密切相關。Janet等于1984年報道金屬錳離子對Uu有抑制作用。ImM錳離子不僅抑制解脲脲原體在液體培養基中的生長或減少其生長比例，同時也改變其菌落形態和細胞的超微結構。然而這種抑制效應是獨立的而且具有種特異性，正是由于這種差別，Janet把解脲脲原體劃分為兩種生物群即 parvum群(Ureaplasma parvum, Up)和urealyticum群(Ureaplasmaurealyticum, Uu)(對于parvum群,猛離子對其生長的抑制是短暫的而對于urealyticum群卻是永久的。)。這是最早的對Uu和Up的劃分。隨著分子生物學的發展，從基因水平對脲原體進行了在系統發生學上的深入研究，Kong等報道在16SrRNA基因序列上Uu和Up存在1%位點的差異特別是在176、177和180-183位點，而它們的各血清型之間卻是一致的。同時Kong也對Uu和Up的16_23SrRNA基因間隔區進行了比對，發現它們之間有14個堿基的差別，而內部各血清型之間也是相似的。隨后Uu和Up之間在脲酶基因、MBA抗原、基因大小等處的差異也相繼報道，從而進一步提出了 Up作為一個獨立的新種即微小脲原體命名的觀點。在臨床致病性上，張帝開等研究表明，在健康婦女中Up為主要的脲原體(82. 5%)，且以血清1、3、6型的單型別陽性為主(共占87. 1%)。KONG等用宮頸拭子直接用PCR法檢測解脲脲原體，共調查了 100例孕婦，解脲脲原體總體陽性率58%，其中Up占91. 4 %。這個提示Up是正常人群攜帶菌的可能性較大。與此同時有研究指出，Uu和Up的毒力不同，其致病性亦不同，Uu或其中的某個血清型更容易致病。有學者認為Uu產脲酶量多，與Up相比，對宿主細胞的毒性更大，致病性更強。因此，2007年國際細菌學分類學會正式做出把解脲脲原體原來的parvum群分出獨立命名為新的物種微小脲原體而urealyticum群仍保留原解脲脲原體命名的決定。當前在我國臨床對解脲脲原體的檢測主要是培養法，以液體培養基顏色變紅診斷為陽性。然而，泌尿生殖道中常含有其他具有脲酶基因的微生物(如，變形桿菌、衣原體等)均可導致培養基變紅，故以培養基顏色判讀結果常出現假陽性的情況。同時，由于傳統的培養方法只能檢測出有脲原體的存在而不能準確對其進行Uu和Up的鑒別，這就限制了不同物種與臨床疾病關系的研究和流行病學的調查。因此，建立一種準確、快速同時能進行Uu和Up檢測鑒定的方法將具有重要的臨床意義。
技術實現思路
本專利技術就是為了解決以液體培養基顏色改變判斷陽性結果的常規培養法出現假陽性結果，且不能準確對其進行Uu和Up鑒別的問題，而提供的一種具有重要的臨床意義的。本專利技術是按以下技術方案實現的。一種，其是按以下步驟進行的 ①.在分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板微孔內，分別加入20 μ I經PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本； 另將分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA-BINDING96孔測定板4個陽性對照孔內，分別加入經PCR擴增后熱變性處理的Uu血清型8標準株產物和Up血清型3標準株產物各20μ I ； 上述各孔分別加180 μ I雜交液混勻，65 1溫箱雜交60min，棄液后，用O. 1%SDS洗液II、TBST洗板，棄液拍干； ②.每孔加入鏈霉親和素辣根過氧化物酶封閉液I: 1000稀釋的混合物50 μ I，室溫放置30分鐘，用TBST洗板后加入含1%SDS的洗液II 200 μ I浸泡15分鐘；再用TBST洗滌，晾干； ③.每孔各加入顯色底物Α、B各50μ I，混勻后置于暗處顯色20分鐘，最后加入終止液50 μ I,以顏色變化判斷結果； ④.經PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本加入終止液后，包被Uu探針的孔變黃或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大于O. 500，而包被Up探針的孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200則證明Uu陽性； 包被Uu探針的孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200，而包被Up探針的孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大于O. 500則證明Up陽性；Uu、Up探針孔同時為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于O. 500則證明同時感染Uu和Up ；而同時為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均小于O. 200則證明無Uu和Up感染；Uu陽性對照Uu探針孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大于O. 500，Up探針孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200 ； Up陽性對照Uu探針孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小于O. 200，Up探針孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大于O. 500。所述，其所述PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本，是將女性受檢者宮頸和陰道分泌物或男性首段尿提取菌液的核酸DNA，經PCR擴增后，100 1水浴變性10分鐘后，立即冰浴5分鐘獲得的； 所述，其所述經PCR擴增后熱變性處理的Uu血清型8標準株產物和Up血清型3標準株產物，是經100 1水浴變性10分鐘后，立即冰浴5分鐘獲得的。所述一種，其Uu特異性探針的核酸序列為5’ NH2-C12-AGC AAT TAA CTT CGC TGA AGG C 3’。所述一種，其Up特異性探針的核酸序列為5’ NH2-C12-GGC AAT TAA TTT CGC TAG TGG T 3’。這樣設計的本專利技術，在對擴增產物的觀測上，采用基于DNA-BINDING96孔板的微反應板的核酸雜交反應進行PCR產物的檢測。該反應過程，與傳統的PCR產物電泳檢測相t匕，提高了檢測的敏感度，同時也實現了高通量的檢測，不僅解決以液體培養基顏色改變判斷陽性結果出現假陽性結果的問題，還能準確地進行Uu和Up的鑒別，可廣泛用于臨床篩查。附圖說明附圖是本專利技術吸光度值坐標圖。具體實施方案 下面結合附圖及實施例對本專利技術進行詳細說明。I.標本女性的宮頸和陰道分泌物；男性首段尿IOml ；Uu,Up陽性對照Up血清型3標準菌株(ATCC 27815)和Uu血清型8標準菌株(ATCC27618),購自 American Type Culture Collection, ATCC。2.標本核酸DNA的提取 a.用無菌棉拭子分別采集女性的宮頸和陰道分泌物，洗脫在磷酸緩沖液(PBS:磷酸二氫鉀(KH2P04) :0. 27g，磷酸氫二鈉(Na2HP04) :1.42g，氯化鈉(NaCl) :8g，氯化鉀(KCl) O. 2g,加本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種解脲脲原體和微小脲原體的檢測方法，其是按以下步驟進行的：①.在分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA?BINDING96孔測定板微孔內，分別加入20μl經PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本；另將分別包被有Uu和Up特異性探針的DNA?BINDING96孔測定板4個陽性對照孔內，分別加入經PCR擴增后熱變性處理的Uu血清型8標準株產物和Up血清型3標準株產物各20μl；上述各孔分別加180μl雜交液混勻，65?℃溫箱雜交60min，棄液后，用0.1%SDS洗液Ⅱ、TBST洗板，棄液拍干；????②.每孔加入鏈親和素辣根過氧化物酶∶封閉液1∶1000稀釋的混合物50μl?,室溫放置30分鐘，用200μl?TBST洗板后加入含1%SDS的洗液Ⅱ浸泡15分鐘；再用TBST洗滌，晾干；③.每孔各加入顯色底物A、B各50μl?,混勻后置于暗處顯色20分鐘,最后加入終止液50μl,以顏色變化判斷結果；④.經PCR擴增后熱變性處理的臨床樣本加入終止液后，包被Uu探針的孔變黃或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大于0.500，而同時包被Up探針的孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小于0.200則證明Uu陽性；包被Uu探針的孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小于0.200，而同時包被Up探針的孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值大于0.500則證明Up陽性；Uu、Up探針孔同時為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于0.500則證明同時感染Uu和Up；而同時為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均小于0.200則證明無Uu和Up感染；Uu陽性對照??Uu探針孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于0.500，Up探針孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小于0.200；Up陽性對照??Uu探針孔為無色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值小于0.200，Up探針孔為黃色或經酶標儀在450nm處測定吸光度值均大于0.500。...

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：劉運德，王蓉，李雪，張楠，谷亞軍，鮑會靜，齊新，李建，
申請(專利權)人：天津醫科大學，
類型：發明
國別省市：