一種檢測BYD病毒的環介導等溫擴增試劑盒及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種檢測BYD病毒的環介導等溫擴增試劑盒及其應用。本發明專利技術提供的專用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。本發明專利技術的專用引物適用于對BYD病毒進行特異性檢測。本發明專利技術的優點：(1)只需在恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊設備；(2)特異性高；(3)快速高效，擴增反應在35分鐘內即可完成；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡單。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，尤其涉及一種檢測BYD病毒的環介導等溫擴增試劑盒及其應用。
技術介紹
BYD病毒，以其分離地白洋淀(Bai Yang Dian)首字母命名，屬黃病毒屬成員，與Tembusu病毒親緣關系較近，該病毒感染鴨后可導致鴨產蛋下降綜合征(Duck Egg-DropSyndrome，DEDS)。該病于2010年首次發現，傳染性非常強。病鴨主要病癥為高熱、食欲廢絕、產蛋下降甚至停止，發病較重的鴨禽甚至喪失行動能力，剖檢可見卵巢發生出血、萎縮、破裂等嚴重病變。我國沿海鴨禽養殖省區包括北京、安徽、河北、福建、廣東，廣西、江蘇、江西、山東、浙江均有流行，無論肉鴨還是蛋鴨均可被該病毒感染，死亡率為5 15%，給各地鴨禽養殖業造成重大經濟損失。·該病尚無有效的檢測手段，血清學上與我國常見黃病毒如登革病毒、日本腦炎病毒等存在一定的血清學交叉反應，目前僅有文獻報道采用普通逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測該病原。環介導等溫擴增法(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)法具有在等溫條件下即可高速、快速、高特異、高靈敏的擴增靶序列的特點。該方法利用特異引物在高活性鏈置換DNA聚合酶作用下，不斷大量復制擴增核酸。核酸大量合成時，dNTP會析出大量的焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與LAMP體系中的Mg2+(或Mn2+)結合，產生焦磷酸鎂或焦磷酸錳沉淀，從而引起反應液的濁度變化，非常易于判斷。此外，利用一些熒光燃料，如SYBRgreen I染料或者鈣黃綠素指示LAMP反應。SYBR green I染料可與雙鏈DNA產物結合，當有產物大量擴增時，反應體系呈現顯著的熒光信號變化。鈣黃綠素在反應初始時與Mn2+結合，反應液顯示透明的橙色，當有核酸產物大量合成時，會生成副產物焦磷酸根，使Mg2+游離出來，與鈣黃綠素結合，最終使反應液顯示微濁的黃綠色。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種檢測BYD病毒的專用引物。本專利技術提供的專用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。所述專用引物還包括引物5，所述引物5的核苷酸序列為序列表的序列5。所述專用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5組成。所述BYD病毒具體為BYD病毒Bydl株。所述專用引物中，F3(引物1)、B3(引物2)、FIP(引物3)、BIP(引物4)和LB(弓I物5)還可進行堿基的替換和/或取代，保持3’末端序列6個堿基100%的同源性即可。FIP和BIP中TTTT (下劃線者)為連接序列，其長度一般為4個，數目可相應縮短和延長。本專利技術的第二個目的是提供一種檢測BYD病毒的環介導等溫擴增(LAMP)試劑。本專利技術提供的試劑，包括RNA逆轉錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環介導等溫擴增緩沖液、所述的專用引物。所述擴增試劑還包括鈣黃綠素；所述擴增試劑由RNA逆轉錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環介導等溫擴增緩沖液、所述的專用引物和鈣黃綠素組成；所述的專用引物中的引物I和引物2在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為5pmol/L ;所述的專用引物中的引物3和引物4在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為40pmol/L ;所述的專用引物中的引物5在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度為20pmol/·L ；所述的引物5可與莖環結構結合啟動鏈置換合成，提高擴增效率。擴增的最后產物是具有不同個數的莖環結構、不同長度DNA的混合物，其產量可達10 μ g以上，是普通PCR反應DNA產率的至少50倍。所述RNA逆轉錄酶在所述環介導等溫擴增試劑中的濃度為O. 004U/ μ L ；所述RNA逆轉錄酶具體為AMV逆轉錄酶；所述Bst DNA聚合酶在所述環介導等溫擴增試劑中的濃度為O. 32U/ μ L ；所述鈣黃綠素在所述環介導等溫擴增試劑中的濃度為50 μ mol/L ；所述2X環介導等溫擴增緩沖液按照如下方法制備將氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸銨((NH4)2SO4)、吐溫 20 (Tween-20)、甜菜堿(Betaine)、氯化錳(MnCl2)和dNTPs (脫氧核苷三磷酸混合物dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于濃度為40mmol/L、PH值為8.8的Tris鹽酸鹽緩沖液得到；在所述2 X環介導等溫擴增緩沖液中，所述氯化鉀的濃度為20mmol/L，所述硫酸鎂的濃度為16mmol/L，所述硫酸銨的濃度為20mmol/L，所述吐溫20的濃度為O. 2% (質量百分含量)，所述甜菜堿的濃度為I. 6mol/L，所述氯化錳的濃度為lmmol/L，每種所述dNTP的濃度均為2. 8mmol/L0所述BYD病毒為BYD病毒Bydl株。本專利技術的第三個目的是提供一種檢測BYD病毒的試劑盒。本專利技術提供的試劑盒，包括所述的環介導等溫擴增試劑；所述BYD病毒具體為BYD病毒Bydl株。所述專用引物或所述的環介導等溫擴增試劑或所述的試劑盒在鑒定和/或輔助鑒定BYD病毒中的應用也是本專利技術保護的范圍。所述BYD病毒具體為BYD病毒Bydl株。本專利技術的第四個目的是提供一種鑒定和/或輔助鑒定待測樣品中BYD病毒的方法。本專利技術提供的方法，包括如下步驟用所述專用引物或所述的環介導等溫擴增試劑或所述的試劑盒中的所述專用引物對待測樣品進行環介導等溫擴增，檢測環介導等溫擴增反應產物；所述環介導等溫擴增中，以待測樣品的RNA為模板；所述環介導等溫擴增反應條件為先60°C -65°C反應30-60min，然后75°C 2min終止反應。所述環介導等溫擴增反應條件為先63°C反應35min，然后75°C 2min終止反應；所述待測樣本為鴨的肝； 本專利技術的檢測對象不局限于鴨的肝，還可涉及鴨的各種臟器，血液標本，糞便標本，以及密切接觸者(人)的相關樣本。所述BYD病毒為BYD病毒Bydl株。所述檢測環介導等溫擴增反應產物的方法為如下I)-4)中的至少一種I)觀察所述環介導等溫擴增反應產物，若所述產物在自然光下為黃綠色，且在紫外光下有熒光(黃綠色熒光)，則待測樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若所述產物在自然光下為橙黃色，且在紫外光下無熒光，則待測樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒；2)用實時濁度儀檢測所述環介導等溫擴增反應產物，若有特異擴增曲線，則待測樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若無特異擴增曲線，則待測樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒；3)電泳檢測所述環介導等溫擴增反應產物，得到梯度樣條帶的擴增反應產物，則待測樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若環介導等溫擴增反應產物不為梯度樣條帶，則待測樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒；所述梯度樣條帶的大小為200bp_2000bp，所述梯度樣條帶的大小主要分布在200bp-2000bp 間；4)用Xho I酶切所述環介導等溫擴增反應產物，電泳檢測所述酶切產物，若所述酶切產物為318bp產物和206bp產物，則待測樣本中含有或者候選含有BYD病毒；若所述酶切產物不為318bp產物和206bp產物，則待測樣本中不含有或者候選不含有BYD病毒。所述檢測環介導等溫擴增反應產物本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測BYD病毒的專用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：秦成峰，姜濤，劉娟，鄧永強，秦鄂德，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所，
類型：發明
國別省市：