本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種檢測(cè)西尼羅病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供的專(zhuān)用引物，包括引物1、引物2、引物3，引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的專(zhuān)用引物適用于對(duì)西尼羅病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：(1)只需在恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊設(shè)備；(2)特異性高；(3)快速高效，擴(kuò)增反應(yīng)在35分鐘內(nèi)即可完成；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡(jiǎn)單。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)特別適用于臨床標(biāo)本和野外現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本的快速檢測(cè)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物
，尤其涉 及一種檢測(cè)西尼羅病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
西尼羅病毒感染導(dǎo)致的西尼羅熱是蚊媒傳播的人畜共患病。多數(shù)患者呈亞臨床癥狀，約20%感染者會(huì)在3-14d后出現(xiàn)西尼羅熱。其病癥可能包括發(fā)燒、頭痛、身體疼痛、淋巴腺腫脹，有時(shí)有出疹癥狀。病癥通常持續(xù)約一周。西尼羅病毒感染可導(dǎo)致病毒性腦炎，引起高燒、頭痛、神志錯(cuò)亂、虛弱無(wú)力，有時(shí)亦會(huì)出現(xiàn)麻痹，偶然會(huì)導(dǎo)致死亡。西尼羅病毒1999年以前主要在非洲、中東、西亞和歐洲流行。1996年羅馬尼亞暴發(fā)歐洲首次西尼羅熱大流行。流行集中在多瑙河流域的14個(gè)地區(qū)，病毒感染率約為1214/10萬(wàn)。1999年俄羅斯南部也暴發(fā)大范圍西尼羅腦炎流行，約有1000病例，至少40人死亡。1999年美國(guó)首次爆發(fā)西尼羅熱流行，這是西半球首次西尼羅熱流行。自此，美國(guó)歷年均暴發(fā)西尼羅熱/西尼羅腦炎流行，且西尼羅病毒分布已從1999年4個(gè)州蔓延到2004年近50個(gè)州，并傳播到加拿大中南部和加勒比海地區(qū)。時(shí)至今日，西尼羅病毒感染已成為全球性嚴(yán)重的公共衛(wèi)生健康問(wèn)題。西尼羅腦炎診斷主要依賴檢測(cè)病毒及其抗體，由于病毒血癥時(shí)病毒載量低，且恢復(fù)期病毒已被清除，因此從血液或者腦脊液中分離病毒較為困難。新的診斷技術(shù)包括用ELISA方法測(cè)抗原、或者用PCR和實(shí)時(shí)PCR測(cè)定西尼羅病毒核酸。其中實(shí)時(shí)PCR是這些診斷技術(shù)方法中最為敏感的，但仍不能檢測(cè)出所有的西尼羅腦炎患者。傳統(tǒng)的這些方法等常需要花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間或者需要特定的儀器，難以滿足暴發(fā)疫情快速診斷的需要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)法具有在等溫條件下即可高速、快速、高特異、高靈敏的擴(kuò)增靶序列的特點(diǎn)。核酸大量合成時(shí)，dNTP會(huì)析出大量的焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與LAMP體系中的Mg2+(或Mn2+)結(jié)合，產(chǎn)生焦磷酸鎂或焦磷酸錳沉淀，從而引起反應(yīng)液的濁度變化，非常易于判斷。此外，利用一些熒光燃料，如SYBR green I染料或者與鈣黃綠素指示LAMP反應(yīng)。SYBRgreen I染料可與雙鏈DNA產(chǎn)物結(jié)合，當(dāng)有產(chǎn)物大量擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系呈現(xiàn)顯著的熒光信號(hào)變化。鈣黃綠素在反應(yīng)初始時(shí)與Mn2+結(jié)合，反應(yīng)液顯示透明的橙色，當(dāng)有核酸產(chǎn)物大量合成時(shí)，會(huì)生成副產(chǎn)物焦磷酸根，使Mg2+游離出來(lái)，與鈣黃綠素結(jié)合，最終使反應(yīng)液顯示微濁的黃綠色。由于LAMP方法試驗(yàn)要求條件低，結(jié)果易于判斷，非常適宜基層病毒的排查，開(kāi)展及時(shí)的動(dòng)物衛(wèi)生防控工作。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)西尼羅病毒的專(zhuān)用引物。本專(zhuān)利技術(shù)提供的專(zhuān)用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。所述專(zhuān)用引物還包括引物5，所述引物5的核苷酸序列為序列表的序列5。所述專(zhuān)用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5組成；所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。所述專(zhuān)用引物中，F(xiàn)3、B3、FIP、BIP、LB的5’端和/或3’端還可根據(jù)靶序列進(jìn)行延長(zhǎng)；所述專(zhuān)用引物中，F(xiàn)3、B3、FIP、BIP、LB還可進(jìn)行堿基的替換和/或取代，保持3’末端序列6個(gè)堿基100%的同源性即可。FIP和BIP中TTTT(下劃線者)為連接序列，其長(zhǎng)度一般為4個(gè)，數(shù)目可相應(yīng)縮短和延長(zhǎng)。本專(zhuān)利技術(shù)的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)西尼羅病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)試劑。本專(zhuān)利技術(shù)提供的試劑，包括RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖 液、所述的專(zhuān)用引物。所述擴(kuò)增試劑還包括鈣黃綠素；所述擴(kuò)增試劑由RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、所述的專(zhuān)用引物和鈣黃綠素組成；所述的專(zhuān)用引物中的引物I和引物2在對(duì)應(yīng)的所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度均為5pmol/L ;所述的專(zhuān)用引物中的引物3和引物4在對(duì)應(yīng)的所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度均為40pmol/L ;所述的專(zhuān)用引物中的引物5在對(duì)應(yīng)的所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度均為20pmol/L ；所述的引物5可與莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動(dòng)鏈置換合成，提高擴(kuò)增效率。擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度DNA的混合物，其產(chǎn)量可達(dá)10 yg以上，是普通PCR反應(yīng)DNA產(chǎn)率的至少50倍。所述RNA逆轉(zhuǎn)錄酶在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為O. 004U/ μ L ；所述RNA逆轉(zhuǎn)錄酶具體為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；所述Bst DNA聚合酶在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為O. 32U/ μ L ；所述鈣黃綠素在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的濃度為50 μ mol/L ；所述2X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液按照如下方法制備將氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸銨((NH4)2SO4)、吐溫 20 (Tween-20)、甜菜堿(Betaine)、氯化錳(MnCl2)和dNTPs (脫氧核苷三磷酸混合物dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于濃度為40mmol/L、PH值為8.8的Tris鹽酸鹽緩沖液得到；在所述2 X環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液中，所述氯化鉀的濃度為20mmol/L，所述硫酸鎂的濃度為16mmol/L，所述硫酸銨的濃度為20mmol/L，所述吐溫20的濃度為O. 2% (質(zhì)量百分含量)，所述甜菜堿的濃度為1.6mol/L，所述氯化錳的濃度為lmmol/L，每種所述脫氧核苷三磷酸的濃度均為2. 8mmol/Lo所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。本專(zhuān)利技術(shù)的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)西尼羅病毒的試劑盒。本專(zhuān)利技術(shù)提供的試劑盒，包括所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑；所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。所述專(zhuān)用引物或所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或所述的試劑盒在鑒定和/或輔助鑒定西尼羅病毒中的應(yīng)用也是本專(zhuān)利技術(shù)保護(hù)的范圍。所述西尼羅病毒具體為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。本專(zhuān)利技術(shù)的第四個(gè)目的是提供一種鑒定和/或輔助鑒定待測(cè)樣品中西尼羅病毒的方法。本專(zhuān)利技術(shù)提供的方法，包括如下步驟用所述專(zhuān)用引物或所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或所述的試劑盒中的所述專(zhuān)用引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增中，以待測(cè)樣品的RNA為模板；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為先60°C _65°C反應(yīng)35-60min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為先63°C反應(yīng)45min或60min,然后75°C 2min終止反應(yīng)；所述待測(cè)樣本為小鼠的腦。本專(zhuān)利技術(shù)的檢測(cè)對(duì)象不局限于小鼠腦組織樣本，還可涉及蚊蟲(chóng)樣本、動(dòng)物或人的血清、腦脊液、尸解腦組織或臟器組織等；所述西尼羅病毒為西尼羅病毒Chin-Ol毒株。所述檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的方法為如下I) _4)中的至少一種I)觀察所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若所述產(chǎn)物在自然光下為黃綠色，且在紫外光下有亮黃色熒光，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；若所述產(chǎn)物在自然光下為橙黃色，且在紫外光下無(wú)熒光，則待測(cè)樣本中不含有或者候選不含有西尼羅病毒；2)用實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，若有特異擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣本中含有或者候選含有西尼羅病毒；若無(wú)特異擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣本中本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)西尼羅病毒的專(zhuān)用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。
【技術(shù)特征摘要】
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：秦成峰，姜濤，劉娟，李曉峰，鄧永強(qiáng)，秦鄂德，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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