一種卡貝縮宮素的純化方法技術

本發明專利技術公開了一種合成卡貝縮宮素的純化方法，該方法包括了反相離子對液相色譜純化合成粗肽，通過離子交換樹脂將離子對試劑脫除，最終得到純度為99.5%的卡貝縮宮素精肽。反相離子對液相色譜的運用，大大提高了純化收率和產品純度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及多肽的純化
，尤其涉及卡貝縮宮素的純化技術。
技術介紹
卡貝縮宮素(Carbetocin)是一種合成的具有激動劑性質的長效催產素九肽類似物，對非妊娠的子宮沒有作用，但是對妊娠的子宮和剛生產的子宮具有有效的子宮收縮作用，其臨床和藥理特性與天然產生的催產素類似。像催產素一樣，卡貝縮宮素與子宮平滑肌的催產素受體結合，引起子宮的節律性收縮，在原有的收縮基礎上，增加其頻率和增加子宮張力。在非妊娠狀態下，子宮的催產素受體含量很低，在妊娠期間增加，分娩時達高峰。硬膜外或腰麻下剖腹產術后可以立即單劑量靜脈給藥，以預防子宮張力不足和產后出血。不論是靜脈注射還是肌肉注射卡貝縮宮素后，子宮迅速收縮，可在兩分鐘內達到一個明確強度。單劑量靜脈注射卡貝縮宮素對子宮的活性作用可持續大約一個小時，因此足以預防剛生產后的產后出血。產后給予卡貝縮宮素后，在收縮的頻率與幅度方面都比催產素要長，并且對有出血傾向、需額外使用縮宮素者，卡貝縮宮素耐受性好，與縮宮素一樣有效甚至更有效。目前臨床常用的促進子宮縮收藥物麥角新堿，會導致惡心、嘔吐、高血壓和冠脈痙攣等。卡貝縮宮素是一種長效的類催產素藥物。與麥角新堿相比，使用卡貝縮宮素在預防陰道分娩婦女的產后出血方面同樣有效，并且惡心、嘔吐、高血壓的發生比例顯著降低。因此，卡貝縮宮素在臨床應用上，具有廣闊的市場前景。卡貝縮宮素常用純化方法通常包括反相高效液相色譜法、凝膠法、離子交換法等，采用任何一種單一方法，都很難分離得到高純產品(< 99%)，或者收率較低(小于50%)。目前，很少有關于其分離純化方面的研究報道，程生強，馬亞平等在其研究中報道，以磷酸緩沖液作為洗脫液，采用反相高效液相色譜法純化卡貝縮宮素，并采用離子交換法轉鹽，得到醋酸卡貝縮宮素，收率為70%-75%，目的肽純度為98%。綜合分析國內外關于合成卡貝縮宮素的純化方法，主要存在兩點問題①采用單一的純化方法，產品純度低；②采用多種純化手段，產品收率低。
技術實現思路
本專利技術針對現有工藝的不足，提出一種卡貝縮宮素的分離純化方法，產品純度高，純化收率高。為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案采用反相離子對液相色譜法，將反相色譜和離子色譜的優勢結合起來，減少純化步驟，提高產品純度，其方法包含以下步驟步驟一、采用反相離子對液相色譜法，以反相色譜柱為固定相，一定濃度離子對試劑水溶液為流動相A相，甲醇或乙腈或乙醇為流動相B相，進行梯度洗脫，洗脫梯度B%為5-40%,優選25%-35%，分三段收集目的峰，分別為峰前、合格品、峰后，合格品為純度達到99. 5%部分，峰前部分保留時間小于合格品的保留時間，純度為90. 0%-99. 5%，峰后部分保留時間大于合格品的保留時間，純度為90. 0%-99. 5%。步驟二、將以上①步得到峰前、峰后部分分別純化，采用反相離子對液相色譜法，以反相色譜柱為固定相，一定濃度離子對試劑水溶液為流動相A相，甲醇或乙腈或乙醇為流動相B相，進行梯度洗脫，洗脫梯度B%為5-40%，優選25%-35%，將得到的合格品合并，得到純度為99. 5%以上的目的肽。步驟三、將以上得到的合格品，采用反相離子對液相色譜法，以反相色譜柱為固定相，一定濃度的補償離子水溶液為A相，甲醇或乙腈或乙醇為流動相B相，進行梯度洗脫，洗脫梯度B%為10-80%,優選30%-70%，將得到的合格品合并，得到純度為99. 5%以上的目的肽。 將洗脫液添加補償離子，包括醋酸、磷酸、鹽酸、三氟乙酸等，得到不同鹽形式的卡貝縮宮素。與已有工藝相比，本專利技術操作簡單，一步純化達到99. 5%的純度，收率達到70%-75%，具有明顯的成本優勢。具體實施例方式本文所述，術語“反相離子對色譜法”指以反相填料為固定相，離子對試劑為流動相的色譜行為，或者是以離子交換填料為固定相，有機溶劑為流動相的色譜行為，目的是結合離子色譜和反相色譜的優勢，高效分離純化合成卡貝縮宮素。本文所述，術語“離子對試劑”包括R-SO3Na或R-SO4Na,其中R選自甲基、乙基、丙基、丁基、戍基、己基、庚基、羊基、壬基、癸基、十一燒基、十_■燒基、十二燒基、十四燒基、十五烷基、十六烷基。下面結合具體實施例對本專利技術進行詳細描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應對本專利技術的保護范圍有任何的限制作用。實施例I : I、預處理將待純化卡貝縮宮素配制成濃度為200-300mg/ml的水 溶液，經孔徑為O. 45um的微孔濾膜過濾，收集濾液。反相色譜柱預處理使用60%的乙腈水溶液沖洗色譜柱6min，再用5%的乙腈水溶液洗6min。離子交換色譜柱預處理濃度為2mol/L的NaOH水溶液再生6min，再用純水洗至中性。2、分離純化取濾液，注入處理好的色譜柱進行分離純化，對目的洗脫 液劃分峰為前、合格品、峰后共三段收集，峰前部分純度90%-99. 5%，合格品部分純度大于99. 5%，峰后部分純度90%-99. 5% ;分別將峰前、峰后部分洗脫液分離純化，色譜條件與原始樣品的分離純化相同。合并合格品，備用。分離純化色譜條件色譜柱以反相C18為固定相的色譜柱，柱子規格為50mmX 250mm ;流動相A相10mmol/L的庚燒磺酸鈉,磷酸調pH至2. O ,流動相B相乙腈，流速為80ml/min ;梯度以乙腈濃度計，25%-35%，時間為40min ;檢測波長為220nm ;上樣量 l_1.2g 3、脫鹽、干燥將經分離純化后卡貝縮宮素合格品注入預處理好的色譜柱，梯度洗脫，收集目的肽；將脫鹽后的卡貝縮宮素目的肽濃縮至120-150mg/ml，低溫冷凍干燥得到凍干粉。產品純度為99. 7%，收率為72. 8%。脫鹽色譜條件色譜柱陽離子交換樹脂普爾樹脂D201，柱子直徑和長度50mmX 400mm;流動相A相0· 1%的醋酸水溶液，流動相B相乙醇；洗脫梯度以乙醇濃度計，30-70%，時間為70min;檢測波長為220nm ;上樣量4. 5-5. Ogo實施例2 I、預處理將待純化卡貝縮宮素配制成濃度為200-300mg/ml的水 溶液，經孔徑為O. 45um的微孔濾膜過濾，收集濾液。 反相色譜柱預處理使用60%的乙腈水溶液沖洗色譜柱6min，再用5%的乙腈水溶液洗6min。離子交換色譜柱預處理濃度為2mol/L的NaOH水溶液再生6min，再用純水洗至中性。2、分離純化取濾液，注入處理好的色譜柱進行分離純化，對目的洗脫 液劃分峰為前、合格品、峰后共三段收集，峰前部分純度90%-99. 5%，合格品部分純度大于99. 5%，峰后部分純度90%-99. 5% ;分別將峰前、峰后部分洗脫液分離純化，色譜條件與原始樣品的分離純化相同。合并合格品，備用。分離純化色譜條件色譜柱以反相C18為固定相的色譜柱，柱子規格為50mmX250mm;流動相A相lOmmol/L的十二烷基磺酸鈉，磷酸調pH至2. O，流動相B相乙腈，流速為80ml/min ;梯度以乙腈濃度計，25% -35%，時間為40min ;檢測波長為220nm ；上樣量1-1. 2g 3、脫鹽、干燥將經分離純化后卡貝縮宮素合格品注入預處理好的色譜柱，梯度洗脫，收集目的肽；將脫鹽后的卡貝縮宮素目的肽濃縮至120-150mg/ml，低溫冷本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種卡貝縮宮素的純化方法，包括以下步驟：①、采用反相離子對液相色譜法分離純化卡貝縮宮素粗肽：以反相色譜填料為固定相，一定濃度的離子對試劑水溶液為流動相A相，甲醇或乙腈或乙醇為流動相B相，純化后得到純度為99.5%以上的精肽；②、采用離子交換色譜法脫除精肽中離子對試劑及其它鹽：將精肽溶液調至合適pH，使得卡貝縮宮素結合在離子交換樹脂上，用純水沖洗除去無機鹽和大部分離子對試劑，再使用一定比例的乙醇水溶液梯度洗脫，將離子對試劑和卡貝縮宮素分開，得到無鹽卡貝縮宮素乙醇水溶液。

【技術特征摘要】
1.一種卡貝縮宮素的純化方法，包括以下步驟 ①、采用反相離子對液相色譜法分離純化卡貝縮宮素粗肽以反相色譜填料為固定相，一定濃度的離子對試劑水溶液為流動相A相，甲醇或乙腈或乙醇為流動相B相，純化后得到純度為99. 5%以上的精肽、采用離子交換色譜法脫除精肽中離子對試劑及其它鹽將精肽溶液調至合適PH，使得卡貝縮宮素結合在離子交換樹脂上，用純水沖洗除去無機鹽和大部分離子對試劑，再使用一定比例的乙醇水溶液梯度洗脫，將離子對試劑和卡貝縮宮素分開，得到無鹽卡貝縮宮素乙醇水溶液。2.如權利要求I所述方法，其特征在于所述反相色譜填料包括C18、C8、C4，但不僅限于 C18、C8、C4。3.如權利要求I所述方法，其特征在于所述離子對試劑包括R-SO3Na或R-SO4Na,其中R選自甲基、乙基、丙基、丁基、戍基、己基、庚基、羊...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳阿娜，
申請(專利權)人：安徽工程大學，
類型：發明
國別省市：