骨保護素變異蛋白制造技術

本發明專利技術涉及新的骨保護素變異蛋白(OVP)，與野生型骨保護素相比，其顯示出減小的與其配體TRAIL的結合親和力。還提供了編碼這些OVP的核酸。還涵蓋了表達這些OVP的重組載體和宿主細胞以及生產重組OVP的方法。本發明專利技術還涉及包含這些OVP的組合物，以及涉及治療以增加骨轉換和/或骨丟失為特征的骨疾病的方法。本發明專利技術的OVP對于防止骨再吸收很有用，并且可以用于治療任何導致不正常骨轉換或骨丟失的病癥，例如骨質疏松癥、高鈣血癥、骨佩吉特病、多發性骨髓瘤、骨癌和由類風濕性關節炎或骨髓炎所致的骨丟失等。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及在調節通過RANK和RANKL的相互作用介導的生物學作用中很有用的進化蛋白。更具體地，本專利技術涉及新的骨保護素變異蛋白，其與野生型骨保護素相比，具有改變的結合特異性。還提供了編碼這些OVP的核酸。還涵蓋表達這些OVP的重組載體和宿主細胞以及生產重組OVP的方法。本專利技術還涉及包含這些OVP的組合物，并且涉及治療與通過RANK和RANKL的相互作用介導的生物學作用相關的疾病的方法。
技術介紹
Rank配體(RANKL) /0PG/RANK生物化學軸已被成功地用于治療骨質疏松癥、 類風濕性關節炎、癌誘導的骨組織破壞、轉移、高韓血癥和疼痛(Hofbauer et al., Cancer 92(3) p. 460-470 (2001)) 利用 0PG(Honore et al. , Nature Medicine 6(5) 521-528(2000))(針對 RANKL 的一種抗體)或者可溶性 RANK-Fc 蛋白(Oyajobi et al.， Cancer Res 61(6) :ρ· 2572-8 (2001))的治療方法也正在開發中。OPG和可溶性RANK-Fc蛋白構建體與RANKL結合，由此減少了可以用于RANK受體活化的RANKL的量。除了在骨生物學中很重要之外，RANKL在免疫系統中通過調節抗原特異性T細胞應答起到重要的作用(Anderson et al. , Nature390 (6656) : 175-9 (1997)) oRANKL在活化的 T細胞上被高度表達，而RANK受體在成熟樹狀突細胞(DC)上以高水平進行表達。RANKL和 RANK之間的相互作用充當共刺激信號，其通過誘導DC分化、細胞因子產生和減少兩種細胞型(DC細胞和T細胞)中的細胞凋亡來增強DC存活和T細胞增生?？赏ㄟ^利用RANK拮抗劑來阻斷共刺激信號而獲得用來產生對移植組織和/或器官的耐受性的免疫療法。阻斷共刺激阻止了 T細胞通過DC細胞的活化,而且使得同種異體反應性T細胞變得無細胞免疫反應性和 /或發生凋亡(Adler et al. , Current Opinion in Immunology 14:660-665(2002))。 通過類似的作用機制，拮抗性RANK信號轉導可以是用于自身免疫和免疫介導的炎性失調如系統性紅斑狼瘡、發炎性腸道疾病、糖尿病、多發性硬化癥、類風濕性關節炎和強直性脊柱炎。骨保護素(OPG)是腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的一種蛋白，并且由Simonet等人首次描述(Cell, 89, 309-319 (1997))。在調節骨生成和轉換的自然過程中，OPG似乎是一個關鍵的元件。已注意到在多種與異常骨代謝有關的疾病中的OPG和它的靶受體RANKL之間的平衡的變化。OPG已進行了臨床前和臨床試驗，其具體在各種與增加的骨轉換和骨丟失相關的疾病(包括骨質疏松癥、風濕性關節炎、佩吉特病(Paget’ s disease)、牙周病、血管疾病和位于骨組織中或轉移至骨組織的癌癥)中應用的效力(對于評論，參見Lorenz et al.， J. Amer Med Assoc 292 =490-5(2004)以及其中的參考文獻)。大量的OPG的動物試驗在文獻中已經報道過，與當前使用的用于減少骨丟失的其它療法相比，表現出相同或者更優異的效果(Simonet et al.，Cell,89,309-319 (1997) ；Bolon et al. ,Cell Mol Life Sci 59， 1569-76(2002))。也已證實OPG能減輕與骨癌相關的疼痛(Luger et al. ,Cancer Research 61,4038-4047(2001))ο在US 6，015，938，US 6，284，740，US 6，284，728，US 6，613，544，US6, 316，408，US 6，288，032和US 6，369，027中詳細地描述了 0PG。在US 6，087, 555中描述了缺少OPG表達的轉基因小鼠。OPG在多發性骨髓瘤病人和骨質疏松癥病人中對于減少骨轉換已經進行了 I期試驗。在患有骨質疏松癥的絕經后女性的開始I/II期試驗中，發現單次注射OPG就可以抑制 30-80% 的骨轉換的標記物數天(Bekker et al. , J. Bone Miner Res 16，348-360 (2001))。 用一定范圍的OPG劑量來治療多發性骨髓瘤病人，并且顯示高達50%的病人在30或者更多天內減少骨吸收(Body et al.，Cancer 97，887-892 (2003))。因此，臨床前研究和臨床研究都有非常強大的證據表明，OPG在各種以異常骨代謝為特征的病癥中可能是一種高度有效的療法。細胞因子的腫瘤壞死因子(TNF)家族和它們的相應受體包括相當多的成員，并且在配體-受體相互作用中在這些成員之間存在實質上的交叉反應性(對于評論，參見 Igney, F. H. and Krammer, P. HNature Reviews Cancer 2, 277-288 (2002))。TNF受體通常引發兩種應答中的一種，或者是凋亡(程序性細胞死亡)應答或者是通過活化轉錄因子NF K B 的對細胞代謝途徑的作用。該受體家族還包括充當假目標(decoy)的成員，以減弱在其它家族配體-受體對之間的相互作用的有效性。OPG看起來屬于這一類的受體。與許多TNF受體家族成員相比，OPG在其目標特異性方面是相對受限制的。根據現有的知識，OPG只結合兩種TNF類配體。I. RANKL (NF κ B配體的受體活化劑)，一種TNF類細胞表面分子，通常與TNF受體家族成員RANK相互作用，而RANK在破骨細胞前體、樹突狀細胞、T細胞和造血細胞前體上表達(Kong et al. , Nature 397:315-323(1999))。RANKL 與 RANK 在細胞表面上相互作用以刺激破骨細胞的生成和活性，而破骨細胞是骨轉換中涉及的主要細胞(Hsu，H et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 96,3540-3545(1999))。RANK 在基質細胞 / 成骨細胞上表達(Kong et al.，Nature397 :315-323 (1999))。OPG 和 RANKL 的相互作用抑制 RANKL 結合 RANK 和刺激破骨細胞的能力，并且正是OPG的這種活性賦予其減少骨丟失的能力(Lacey et al.， Amer J Pathol 157，435-448 (2000) ；Simonet et al.，Cell, 89, 309-319 (1997))。結合于 RANKL 的二聚 OPG 的結合常數已被報道為 6. 7nM (Wi I lard et al. ,Protein Expr. Purif 20， 48-57 (2000))，而其它的報道將結合常數置于2nM和IOnM之間。2. TRAIL(TNF相關的凋亡誘導配體)，一種TNF類細胞表面分子，涉及誘導癌細胞中的細胞凋亡。OPG被認為是少數用于TRAIL的假目標受體中的一種，用來調節其靶向癌細胞的能力(在上面參考的Igney a本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種與野生型OPG相比包括至少一個修飾的OPG變異蛋白，其中，與野生型OPG相比，所述OPG變異蛋白保持對于RANKL的結合親和力，但是表現出減小的對于TRAIL的結合親和力。

【技術特征摘要】
2004.12.13 US 60/635,7221.一種與野生型OPG相比包括至少一個修飾的OPG變異蛋白，其中，與野生型OPG相t匕，所述OPG變異蛋白保持對于RANKL的結合親和力，但是表現出減小的對于TRAIL的結合親和力。2.根據權利要求I所述的OPG變異蛋白，其包括在由氨基酸殘基102-130包圍的區域中的至少一個修飾。3.根據權利要求2所述的OPG變異蛋白，其包括在殘基位置102、111、115、122、128或130處的至少一個氨基酸替代。4.根據權利要求2所述的OPG變異蛋白，其包括在包含殘基107-118的環結構中的至少一個修飾。5.根據權利要求4所述的OPG變異蛋白，其包括在位置115處的修飾。6.根據權利要求5所述的OPG變異蛋白，其中，在位置115處的Ile被Thr、Met、Val、Asp、Gly、Ser 或 Arg 替代。7.根據權利要求2所述的OPG變異蛋白，其包括在殘基122處的修飾。8.根據權利要求7所述的OPG變異蛋白，其中，在位置122處的Arg被Gly、Gin、Ser,Asn或Glu替代。9.根據權利要求2所述的OPG變異蛋白，其包括在位置128處的修飾。10.根據權利要求9所述的OPG變異蛋白，其中，在位置128處的Phe被Val、Ala、Leu、Ile或Ser替代。11.根據權利要求2所述的OPG變異蛋白，其包括在殘基130處的修飾。12.根據權利要求11所述的OPG變異蛋白，其中，在位置130處的Val被Glu或Ala替代。13.根據權利要求I至12中任一項所述的OPG變異蛋白，其包括至少兩個修飾。14.根據權利要求13所述的OPG變異蛋白，其包括在由殘基122-130包圍的區域中的至少兩個修飾。15.根據權利要求14所述的OPG變異蛋白，其包括選自由以下構成的組中的至少兩個修飾(i)R122N和 I115M ；(ii)R122N和I115M ；(iii)F128S和I115M ；(iv)F128I和 I115M ;和(v)F128L和 I115M。16.根據權利要求13所述的OPG變異蛋白，其包括在由殘基122-130包圍的區域中的至少一個修飾和在這個區域外的至少一個另外的修飾。17.根據權利要求16所述的OPG變異蛋白，其中，所述另外的修飾發生在殘基31、40、51、100、155、167或168中的任何一個或多個上。18.根據權利要求16所述的OPG變異蛋白，其中，所述另外的修飾發生在殘基Gln21、Glu22、Thr23、Phe24、Pro25、Pro26、Lys27、Tyr28、Leu29、His30、Tyr31、Asp32、Glu33、Glu34、Thr35、Ser36、His37、Gln38、Asp42、Lys43、Pro45、Pro46、Thr48、Lys5U Gln52、His53、Cys54、Thr55、Ala56、Lys57、Trp58、Lys59、Thr60、Val61、Ala63、Pro64、Pro66、Asp67、His68、Tyr69、Asp72、Ser73、Trp74、Thr76、Ser77、Asp78、Glu79、Leu81、Tyr82、Ser84、Pro85、Val86、Lys88、Glu89、Leu90、Tyr92、Val93、Lys94、Gln95、Glu96、Asn98、Arg99、Thrl00、Hisl01、Vall31、Glnl32、Alal33、Glyl34、Thrl35、Prol36、Glul37、Argl38、Vall41、Lysl43、Argl44、Cysl45、Prol46、Aspl47、Glyl48、Phel49、Phel50、Serl51、Asnl52、Glul53、Thrl54、Serl55、Se...

【專利技術屬性】
技術研發人員：安東尼·羅伯茨，喬治·科普西達斯，格雷戈里·科亞，梅里琳·斯萊，文森特·巴托里，
申請(專利權)人：賽弗隆澳大利亞VIC私人有限公司，
類型：發明
國別省市：