本發明專利技術公開了細胞色素結合結構域蛋白作為助分泌因子提高外源蛋白在畢赤酵母中分泌的用途。將細胞色素結合結構域蛋白編碼基因按畢赤酵母密碼子偏好進行優化并與外源基因進行融合得到融合基因，將融合基因轉化到畢赤酵母中進行分泌表達能顯著提高外源基因在畢赤酵母中的分泌表達量。由此，本發明專利技術提供了細胞色素結合結構域蛋白作為助分泌因子或其編碼基因作為助分泌基因的新用途。此外，融合有細胞色素結合結構域蛋白編碼基因的融合基因所表達的融合蛋白在分泌出畢赤酵母細胞外的過程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白質和細胞色素結合結構域蛋白質，使外源蛋白質的N端不增加額外的序列，不影響分泌蛋白質的理化性質。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細胞色素結合結構域蛋白及其編碼基因的新用途，尤其涉及細胞色素結合結構域蛋白及其編碼基因作為助分泌因子或助分泌基因以提高外源基因在畢赤酵母中分泌表達量中的新用途，屬于細胞色素結合結構域蛋白或其編碼基因的用途領域。
技術介紹
畢赤酵母(Pichia pastoris)是單細胞真核生物，既有類似原核生物的生長特征， 又有一般真核生物的細胞生物學特性，是目前最成功的外源基因真核表達系統。畢赤酵母表達系統具有易于操作培養，高密度發酵水平很高，表達菌株穩定，正確翻譯和翻譯后加工修飾更接近于高等真核生物等優點。除此之外畢赤酵母極少分泌自身蛋白，在其培養液中除目的蛋白外，幾乎不含任何其它蛋白，這樣就使得目的蛋白的純化變得非常簡單，而且許多外源基因的分泌表達量可達到每升克級以上，因此利用該系統可以極大的降低目的蛋白的生產成本。但是，如果目的蛋白不能分泌到胞外，其產量一般不會高于細胞總蛋白量的 1%，并且目的蛋白的純化將變得非常復雜，蛋白質的生產成本自然也會非常高。因此盡管科研人員非常希望利用畢赤酵母高效分泌表達外源基因，然而到目前為止仍然有許多基因 (尤其是那些在原始菌或細胞中不分泌表達的基因)不能在畢赤酵母中分泌表達或分泌表達量非常低，這個問題也成為限制該表達系統更廣泛應用的一個關鍵因素。有研究發現若蛋白在畢赤酵母中表達但不分泌，可以通過在蛋白質N端融合一些蛋白質標簽來，表達提高目的蛋白的分泌量。已有的助分泌因子主要有谷胱甘肽轉移酶 (glutathione-S-transf erase, GST),綠色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP), 硫氧還蛋白(thioredoxin),泛素(ubiquitin),纖維素結合結構域(cellulose binding domain, CE )，翻譯起始因子 IF2 的 Domainl,綠色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)以及來源于大腸桿菌的麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein,MBP)。這些蛋白質標簽可以提高一些特定蛋白質在畢赤酵母中的分泌量。細胞色素結合結構域蛋白(Cytochromes heme binding domain, CHBD)為蛋白質細胞色素b5 (cytochrome b5)中N端的一部分(N端100個氨基酸)。該蛋白質廣泛存于高等動物內質網膜，具有分子量小、可溶性大、穩定性高等優點，作為電子傳遞蛋白，可參與生物體組織中一系列重要的氧化還原反應，如脂質和類固醇的合成代謝等。
技術實現思路
本專利技術的主要目的是提供細胞色素結合結構域蛋白的一種新用途；本專利技術的另外一個目的是提供一種提高外源基因在畢赤酵母中分泌表達量的方法。本專利技術的上述目的是通過以下技術方案來實現的本專利技術通過試驗發現，將細胞色素結合結構域蛋白(CHBD)編碼基因(SEQ IDNo. I)與外源基因進行融合并轉化到畢赤酵母中進行分泌表達，能有效提高外源基因在畢赤酵母中的分泌表達量。進一步的，本專利技術將細胞色素結合結構域蛋白編碼基因通過密碼子優化、提高mRNA 二級結構的穩定性等措施得到優化的細胞色素結合結構域蛋白編碼基因(CHBD-O) (SEQ ID No. 2)，將該優化的細胞色素結合結構域蛋白編碼基因與外源基因進行融合并轉化到畢赤酵母中進行分泌表達，能夠非常顯著的提高外源基因在畢赤酵母中的分泌表達量。由此，可將細胞色素結合結構域蛋白作為助分泌因子或將細胞色素結合結構域蛋白編碼基因或優化的細胞色素結合結構域蛋白編碼基因作為助分泌基因應用于提高外源基因在畢赤酵母中的分泌表達量。本專利技術按照畢赤酵母的偏嗜性對細胞色素結合結構域蛋白(CHBD)編碼基因進行了優化，通過在原始的CHBD或優化后的CHBD-O標簽的C端引入能在畢赤酵母中能被KeX2 蛋白酶識別的切割位點(EKREAEA) (SEQ IDNo. 5)，然后再加上外源基因得到融合基因，所表達的融合蛋白在分泌出胞外的過程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白質和CHBD助分泌因子，能夠更有效的提高外源基因的分泌表達量；由于該方法在外源蛋白質的N端不增加多余的序列，因而不會影響分泌蛋白質的理化性質。本專利技術通過進一步的研究發現，細胞色素結合結構域作為蛋白標簽可以提高許多種蛋白質(如甲基對硫磷水解酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶等)的分泌表達量，具有較好的應用前景。本專利技術的另一個目的是提供一種提高外源基因在畢赤酵母中分泌表達量的方法， 該方法包括以下步驟將細胞色素結合結構域蛋白編碼基因或優化的細胞色素結合結構域蛋白編碼基因與外源基因融合在一起，得到融合基因；將融合基因與酵母表達載體可操作性的連接在一起構建得到含有所述融合基因的重組酵母表達載體；將所述重組酵母表達載體轉化到畢赤酵母中進行分泌表達。優選的，將將細胞色素結合結構域蛋白編碼基因與外源基因融合之前，先將細胞色素結合結構域蛋白的C端引入在畢赤酵母中能被KeX2蛋白酶識別的切割位點 (EKREAEA)，然后再加上外源基因。作為本專利技術一個優選的具體實施方案，本專利技術將細胞色素結合結構域蛋白的C端引入在畢赤酵母中能被KeX2蛋白酶識別的切割位點(EKREAEA)，然后再加上甲基對硫磷水解酶(mph)編碼基因，得到融合基因CHBD-O-MPH ;將該融合基因與畢赤酵母表達載體 pPIC9相連接構建得到重組畢赤酵母表達載體pPIC9-chbd-o-mph ;作為對照,本專利技術將甲基對硫磷水解酶基因與畢赤酵母表達載體PPIC9相連接構建得到重組畢赤酵母表達載體 pPIC9-mph ;將所構建的重組畢赤酵母表達載體pPIC9-chbd-o_mph以及pPIC9_mph分別轉化到畢赤酵母中進行分泌表達；試驗結果發現，沒有融合細胞色素結合結構域蛋白基因的 MPH在畢赤酵母表達時分泌量極低，其在畢赤酵母中表達分泌量極低，通過測量50個陽性克隆子，經誘導后其上清平均酶活性為O. 02U/mL。而將助分泌因子(CHBD-O)融合至mph的 N-端后，挑取50個陽性克隆子，經搖瓶誘導培養研究發現，CHBD-O-MPH的畢赤酵母重組菌株經誘導培養基上清平均能達到O. 31U/mL,因此該融合蛋白使MPH的畢赤酵母表達分泌量提高13倍，因此CHBD或CHBD-O助分泌因子可用于提高MPH等外源基因在畢赤酵母中的分泌表達量。此外，融合蛋白表達后在分泌出胞外的過程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白質和CHBD助分泌因子質，外源蛋白質的N端不增加額外的序列，因而不會影響分泌蛋白質的理化性質。附圖說明圖I對硝基酚含量測定標準曲線。圖2重組畢赤酵母表達載體pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph的圖譜。圖3MPH、融合標簽CHBD-MPH、融合標簽CHBD-O-MPH畢赤酵母表達初篩菌株誘導上清酶活分布箱須圖；1 :畢赤酵母中單獨表達MPH的初篩菌株誘導48h后上清酶活分布；2 畢赤酵母中表達MPH的N端融合CHBD的初篩菌株誘導48h后上清酶活分布；3 :畢赤酵母中表達MPH的N端融合優化的CHBD的初篩菌株誘導48h后上清酶活分布；箱外圓圈表示異常值，箱三條橫線代本文檔來自技高網...
【技術保護點】
細胞色素結合結構域蛋白作為助分泌因子在提高外源基因在畢赤酵母(Pichia?pastoris)分泌表達量中的應用；其中，所述細胞色素結合結構域蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?No.3所示。
【技術特征摘要】
1.細胞色素結合結構域蛋白作為助分泌因子在提高外源基因在畢赤酵母(Pichiapastoris)分泌表達量中的應用；其中，所述細胞色素結合結構域蛋白的氨基酸序列為SEQID No. 3 所示。2.優化的細胞色素結合結構域蛋白編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQIDNo. 2所示。3.一種融合基因，其特征在于含有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。4.細胞色素結合結構域蛋白編碼基因或權利要求2所述優化的細胞色素結合結構域蛋白編碼基因作為助分泌基因在提高外源基因在畢赤酵母(Pichia pastoris)分泌表達量中的應用。5.按照權利要求4所述的應用，其特征在于，包括將細胞色素結合結構域蛋白編碼基因或優化的細胞色素結合結構域蛋白編碼基因與外源基因融合得到融合基因；將融合基因轉化到畢赤酵母中進行分泌表達。6.按照權利要求5所述的應用，其特征在于所述的融合是將細胞色素結合結構域蛋白的C端引入能在畢赤酵母中能被KeX2蛋白酶識別的切割位點，然后再加上外源基因；其中，所述切割位...
【專利技術屬性】
技術研發人員：田健，伍寧豐，初曉宇，黃璐，王平，
申請(專利權)人：中國農業科學院生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。