一種mRNA快速提取試劑盒制造技術

一種mRNA快速提取試劑盒及其制備方法。所述試劑盒包括一套用于固、液相分離的分離裝置；所述分離裝置中至少包含一層纖維素固相載體；該試劑盒還包括下述所有成份：至少有一管為細胞或組織裂解液；至少有一管為生物素化Oligo(dT)探針；至少有一管為結合緩沖液；至少有一管為洗脫緩沖液。該試劑盒操作簡便、快速、高效，適合用于生物樣品中mRNA的分離提取。其主要特征在于分離裝置中采用纖維素為固相載體，利用融合蛋白CBD-SA作為生物橋聯劑，以生物特異性偶聯法代替傳統的物理吸附法和化學鍵合法活化纖維素固相載體，活化后的固相載體能夠高效率的結合生物素化的試劑，可用于蛋白或核酸的分離。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種mRNA快速提取試劑盒及其制備方法，屬于生物

技術介紹
mRNA為messenger RNA的簡稱,或稱為信使RNA。mRNA由DNA經由轉錄而來，帶著相應的遺傳訊息，為下一步轉譯成蛋白質提供所需的訊息。目前，隨著分子生物學的日益發展，從真核細胞或組織中高效提取完整的mRNA是cDNA文庫構建、EST測序、Northern斑點雜交、微陣列基因表達分析及實施定量PCR等功能基因組應用的關鍵步驟。在哺乳動物中， 大量的RNA分子是以tRNA和核糖體RNA的形式存在，而mRNA僅占總RNA的1_5%。傳統的mRNA提取包括兩步；首先，采用Trizol等方法從細胞或組織中提取總 RNA,然后再利用Oligo (dT)纖維素柱純化mRNA。因為mRNA末端含有多poly (A) +，當總RNA 流徑Oligo (dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在Oligo (dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過兩次Oligo (dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。這種方法的缺點是耗時長，引入酚、氯仿等有機試劑，由于RNA容易被降解，因此得率較低。隨著磁性分離載體的不斷發展，在mRNA提取中，產生了磁性捕獲-雜交技術。另外，利用鏈霉親和素一生物素的親和反應平臺，相繼出現了采用一步法提取動物組織、植物組織、真核細胞、原核細胞等mRNA的報道。磁性捕獲一雜交技術與傳統的mRNA提取方法相比，具有快速、操作簡單和高效的優點[。這主要是因為，避免了傳統方法中酚-氯仿抽提和沉淀等步驟造成的目標分子的損失，同時有效地抑制了細胞內外RNase的降解作用，因此能夠提高mRNA的產量。目前，市售的用于mRNA提取的磁球主要有兩類，一類是Oligo (dT) 25磁性微球，一類是鏈酶親和素順磁顆粒(Streptavidin Paramagnetic Particles, SA-PMPS)，但價格都相對比較昂貴。而且，到目前為止，所有的方法都無一例外地采用了化學方法將Oligo (dT)或SA固定于固相載體上。因此本研究致力于研究一種操作簡單、安全可靠、高效穩定、無須引入化學試劑的mRNA提取方法。生物固相化技術是通過固相基質材料，表面吸附或結合來捕獲液相中的靶分子， 借助重力、壓力、離心、過濾等，經一步或多步操作即可方便的將未結合的液相與固相分離， 從而獲得純的目的分子。纖維素結合域(CBD)是纖維素酶和半纖維素酶基因的組成部分，與纖維素具有高親和力，以此作為橋聯劑將SA固定于纖維素濾紙表面，由于CBD的存在，可有效減小空間位阻，并且該偶聯為生物特異性偶聯，不易脫落，也不會引入有機試劑，能更好的保證SA的生物活性。同時，采用市售的纖維素濾紙，無須復雜加工，用CBD-SA生物特異性活化即可成為具有特定功能的固相載體，成本小，操作方便，利于商業化大規模生產。
技術實現思路
本專利技術的目的是為mRNA的提取提供一種簡便、高效、安全的新方法，涉及融合蛋白CBD-S對纖維素固相載體的生物特異性活化、采用此生物活化的固相載體用于mRNA提取的方法以及試劑盒。本專利技術的主要特征是利用融合蛋白CBD-SA作為生物橋聯劑，以生物特異性偶聯法代替傳統的物理吸附法和化學鍵合法，使纖維素固相載體活化，活化后的固相載體能夠高效率結合生物素化的試劑。因此，以生物素化的Oligo (dT)為探針，與細胞或組織等生物樣品的裂解液中帶有PoIy (A)尾巴的mRNA雜交，再利用鏈酶親和素一生物素的高親和力，可以從組織或細胞裂解液中成功釣取mRNA，原理圖見圖I。本專利技術提供的mRN A快速提取試劑盒，包括一套用于固、液相分離的分離裝置，所述分離裝置中至少包含一層纖維素固相載體；該試劑盒還包括下述所有成份I)至少有一管為細胞或組織裂解液；2)至少有一管為生物素化Oligo (dT)探針；3)至少有一管為結合緩沖液；4)至少有一管為洗脫緩沖液。所述纖維素固相載體是表面被融合蛋白CBD-SA生物活化的固相基質，具體是利用融合蛋白CBD-SA作為生物橋聯劑，以生物特異性偶聯法代替傳統的物理吸附法和化學鍵合法，使纖維素固相載體活化，活化后能夠高效率的結合生物素化的試劑。所述纖維素固相載體為纖維素濾紙，脫脂棉以及其他可接受的天然的或修飾后的纖維素固相材料。所述的固、液相分離的分離裝置是下述用品中的任意一種I)雙層微型離心管，由內層的固、液相分離管和外層的離心管組成，在分離管的下端是微孔膜或篩網樣結構，使纖維素濾紙層固定在分離管內，將流過的液體收集在離心管中；2)微分離柱，由柱體、出液口和篩網樣結構組成,篩網允許液體流過而將纖維素濾紙固定在柱體內，使液體與固相分離；3) 一種微型過濾器，由微孔濾膜、微膜支板和濾器組成。本專利技術的優點和有益效果本專利技術提供的方法可以方便、迅速地從組織或細胞等生物樣品中分離提取mRNA，而無須引入任何化學試劑；而且，本專利技術涉及的CBD-SA生物活化的纖維素固相載體，可采用市售的纖維素濾紙，脫脂棉以及其他可接受的天然的或修飾后的纖維素固相材料為原材料，采用生物工程菌株表達的CBD-SA進行生物致敏，操作簡便，成本低，且避免了傳統化學方法中引入化學試劑，更加安全、環保。附圖說明圖I是mRNA提取的原理圖。圖2是幾種常見的固、液相分離裝置的外觀結構和工作原理示意中A，一種微分離柱，由柱體I、出液口 2和篩網樣結構3組成，加入與Oligo(dT)結合的細胞或組織裂解液上清，使液相與固相完全分離，裂解液上清中的與Oligo (dT)結合的mRNA被吸附到固相上，而廢液則被收集到試管中；圖中B，一種雙層微型離心管，由內層的固、液相分離管4和外層的離心管5組成，在分離管的下端是微孔膜或篩網樣結構6，可允許液體通過，加入與Oligo (dT)結合的細胞或組織裂解液上清，裂解液上清中的與Oligo(dT)結合的mRNA與固相結合，滯留在分離管內，通過的液體被收集在離心管中；圖中C，一種微型過濾器，由微孔濾膜7、微膜支板8和濾器9組成；與Oligo (dT)結合的細胞或組織裂解液上清與生物活化的纖維素固相載體結合后，裂解液上清中的與Oligo (dT)結合的mRNA與固相結合，與固相一起滯留在過濾器中，而廢液則通過過濾器，收集于試管中；打開濾器取出固相，用RNase - free的ddH20洗脫固相，即可獲得mRNA。圖3是目的基因的RT-PCR分析。M :標準分子量 DNA DL2000,從上至下分別為 2000bp，IOOObp，750bp, 500bp,250bp，和IOObp ；1 :從大鼠心臟組織中分離mRNA后擴增的管家基因-GAPDH基因；2 :從RIN-m5F細胞系中分離mRNA后擴增的大鼠胰島素基因。 具體實施例方式本專利技術提供的mRNA快速提取試劑盒的組成包括，一套用于固、液相分離的分離裝置；所述分離裝置中至少包含一層纖維素固相載體；該試劑盒還包括下述所有成份I)至少有一管為細胞或組織裂解液；2)至少有一管為生物素化Oligo (dT)探針；3)至少有一管為結合緩沖液(75mMNaCl，8. 5mM檸檬酸鈉，pH7. 2)；4)至少有一管為洗脫緩沖液(Nuclease-Free Water)本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種mRNA快速提取試劑盒，其特征在于該試劑盒包括一套用于固、液相分離的分離裝置，所述分離裝置中至少包含一層纖維素固相載體；該試劑盒還包括下述所有成份：1）至少有一管為細胞或組織裂解液；2）至少有一管為生物素化Oligo(dT)探針；3）至少有一管為結合緩沖液；4）至少有一管為洗脫緩沖液。

【技術特征摘要】
1.一種mRNA快速提取試劑盒，其特征在于該試劑盒包括一套用于固、液相分離的分離裝置，所述分離裝置中至少包含一層纖維素固相載體；該試劑盒還包括下述所有成份 O至少有一管為細胞或組織裂解液； 2)至少有一管為生物素化Oligo(dT)探針； 3)至少有一管為結合緩沖液； 4)至少有一管為洗脫緩沖液。2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的分離裝置中的纖維素固相載體是表面被融合蛋白CBD-SA生物活化的固相基質，具體是利用融合蛋白CBD-SA作為生物橋聯齊U，以生物特異性偶聯法代替傳統的物理吸附法和化學鍵合法，使纖維素固相載體活化，活化后能夠高效率的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：高智慧，白鋼，
申請(專利權)人：天津啟仁醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：