本發明專利技術公開了一種同時分離內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和表皮細胞的原代培養方法，皮膚成纖維細胞株和表皮細胞株的構建包括以下步驟：(1)采樣；(2)內蒙古白絨山羊耳尖皮膚組織原代培養；（3）皮膚成纖維細胞與上皮細胞的分離與純化。本發明專利技術經過一次原代培養同時獲得了高活力的內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞株和表皮細胞株,為深入開展內蒙古白絨山羊轉基因研究、分子生物學及細胞生物學的相關研究提供了試驗材料與技術支持。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于細胞培養
，具體而言，涉及以取自活體內蒙古白絨山羊耳部皮膚組織塊為材料，同時分離內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和表皮細胞的原代培養方法。
技術介紹
內蒙古白絨山羊是經過長期自然選育形成的優良地方性絨肉兼用型品種，所產羊絨具有徑細絨長、綜合品質優良的特點。然而，由于近年來草場退化，種群數量增加，舍飼比例加大，導致內蒙古白絨山羊的產絨量降低。通過轉基因技術導入促進毛囊發育和絨毛生長的功能基因，培育高產絨量新品系是解決這一問題的有效手段。在高產絨量轉基因絨山羊新品系的研究中，構建功能基因的皮膚特異性表達載體是關鍵步驟之一，而實現功能基因在皮膚特異性表達的關鍵在于構建載體時在功能基因上游引入皮膚特異性表達的啟動子元件，以驅動功能基因的表達。在實際操作中，選擇的皮膚特異性 啟動子的功能首先需得到驗證，具體包括兩個方面一方面是這個啟動子在皮膚細胞中的有效性，即是否工作及工作效率如何；另一方面是啟動子的特異性，即應該是只在皮膚細胞中表達，在其它細胞中不表達或表達微弱。要實現啟動子功能的驗證，唯一簡單的辦法是將含有皮膚特異性啟動子的載體同時轉染皮膚細胞和其它非細胞，進而檢測其有效性和特異性。鑒于此，通過試驗研究獲得內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞株及表皮細胞株， 這顯得尤為重要。細胞培養技術是生命科學研究領域的重要手段，細胞的生長需要一定的營養環境，包括溫度、濕度、氣體及培養液。用于維持細胞生長的營養基質稱為培養液。目前商品化的細胞培養液較多，有MEM系列，DMEM，RPMI-1640系列，199系列等。迄今，在眾多培養液中，哪種培養液可以用于絨山羊皮膚成纖維細胞及表皮細胞的培養尚未見報道。另外，通過一次原代培養同時獲得絨山羊皮膚成纖維細胞株和表皮細胞株的方法亦在現有技術中未見報道。
技術實現思路
鑒于現有技術的不足，本專利技術的目的在于通過研究同時分離內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和表皮細胞的原代培養方法，從而獲得內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞株和表皮細胞株，為開展內蒙古白絨山羊分子生物學和細胞生物學的相關研究及轉基因研究提供了試驗材料。本專利技術的目的是這樣實現的—種同時分離內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和表皮細胞的原代培養方法，皮膚成纖維細胞株和表皮細胞株的構建包括以下步驟(I)采樣從雄性成年內蒙古白絨山羊個體的耳尖部取皮膚組織，用含雙抗的生理鹽水沖洗，然后去除附著在皮膚上的脂肪和結締組織基膜層，露出真皮層后，置于70-75% (v/v)酒精中浸泡約45-60s后，再用含雙抗的PBS洗滌，置于含雙抗的DMEM/F12培養液中， 剪碎；(2)內蒙古白絨山羊耳部皮膚組織原代培養將皮膚組織塊均勻接種在培養瓶的瓶壁，加入含胎牛血清、表皮細胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養液，擰緊瓶蓋，以組織塊在上、培養液在下的方式放入培養箱，靜置3 4h后，輕輕將培養瓶翻轉，使培養液浸沒組織塊，在培養箱內靜置培養，每2-4d更換一次新鮮培養液，培養Il-17d后，得到皮膚成纖維細胞與上皮細胞的混合原代細胞培養物；(3)皮膚成纖維細胞與上皮細胞的分離與純化將步驟(2)所得混合原代細胞培養物用PBS清洗，再用l-2mL含O. 25% (w/v)胰蛋白酶和O. 02%EDTA (w/v)的D-Hanks液消化，至大部分細胞回縮及有少量細胞漂起后，立即終止消化，用移液槍吹打使細胞懸浮， 吸取細胞懸液離心棄上清后，接種入新的培養瓶中，放入培養箱培養，通過2 3次選擇傳代，得純化的皮膚成纖維細胞株；吸取所述細胞懸液后的培養瓶用PBS洗滌，加入含胎牛血清、表皮細胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養液繼續放入培養箱培養，待表皮細胞長滿瓶底時，消化傳代，通過2 3次選擇傳代，得純化的表皮細胞株。本專利技術的目的還可以這樣實現所述的雙抗是終濃度為100IU/mL的青霉素和100IU/mL的鏈霉素。所述的PBS由8g/L氯化鈉、O. 2g/L氯化鉀、I. 44g/L磷酸氫二鈉和O. 24g/L磷酸二氫鉀組成，pH=7. 4。步驟(2)和(3)中所述含胎牛血清、表皮細胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養液是含10% (v/v)胎牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素及15ng/mL表皮細胞生長因子的DMEM/F12培養液。步驟(2)和(3)中所述培養箱為37°C、含5%C02，的飽和濕度空氣的二氧化碳培養箱。與現有技術相比，本專利技術涉及的分離內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和表皮細胞的原代培養方法具有以下優點和顯著進步(I)本專利技術通過研究同時獲得了內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和表皮細胞的原代培養方法，進而獲得了內蒙古白絨山羊的皮膚成纖維細胞株和表皮細胞株，為開展內蒙古白絨山羊轉基因研究及分子生物學和細胞生物學的相關研究提供了試驗材料。(2)本專利技術在進行組織塊貼壁法原代培養時，根據上皮細胞與成纖維細胞對TE液 (含0. 25%胰蛋白酶和0. 02%EDTA的D-Hanks液)消化敏感性的不同及二者貼壁強度的差異， 將二者分離、純化。具體而言，通過控制合適的消化時間使成纖維細胞脫壁，而上皮細胞因脫壁較慢仍貼在培養瓶壁上，分瓶培養后，只需經過幾次傳代就可以得到純化的皮膚成纖維細胞(參見圖2 )、表皮細胞(參見圖3)，通過一次原代培養同時獲得了高活力的內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和表皮細胞兩種細胞株。附圖說明圖I為本專利技術內蒙古白絨山羊耳尖皮膚組織經培養前消毒處理及剔毛處理后，采用組織塊貼壁法進行原代培養，經8天培養組織塊周圍有成纖維細胞和表皮細胞長出，環繞于組織塊周圍；A為皮膚成纖維細胞，B為表皮細胞，C為皮膚組織塊。圖2為本專利技術原代培養的皮膚細胞經過3次傳代以后得到的較純的皮膚成纖維細胞，細胞呈梭型。圖3為本專利技術原代培養的皮膚細胞經過3次傳代以后得到的較純的表皮細胞，細胞呈圓形。圖4為本專利技術獲得的皮膚成纖維細胞的染色體數量分析圖，染色體數量為2n=60。圖5為本專利技術獲得的表皮細胞的染色體數量分析圖，染色體數量為2n=60。圖6為本專利技術獲得的皮膚成纖維細胞的生長曲線圖。圖7為皮膚特異性表達載體pDsR-K14p轉染本專利技術獲得的皮膚成纖維細胞和胎兒成纖維細胞48小時紅色熒光表達情況照片；A、B為胎兒成纖維細胞，C、D為皮膚成纖維細胞;A、C為光鏡照片，B、D為熒光照片；皮膚成纖維細胞中紅色熒光蛋白的表達量較胎兒成纖維細胞為多。圖8 為表達載體 K 14p-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsRK14p 轉染絨山羊胎兒成纖維細胞48h的VEGF表達實時定量PCR分析圖，轉染組細胞中VEGF表達量與對照組差別不大。圖9 為表達載體 K 14p-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsR_K14p 轉染絨山羊皮膚成纖維細胞48h的VEGF表達實時定量PCR分析圖，轉染組細胞中VEGF表達量與對照組差別較大。圖10 為表達載體 K 14p-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsR_K14p 轉染絨山羊皮膚成纖維細胞或胎兒成纖維細胞48h，轉染細胞及對照組細胞中VEGF的表達量比較圖；K14p-VEGF-K14PoIyA-Loxp - pCDs本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種同時分離內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和表皮細胞的原代培養方法，其特征在于：皮膚成纖維細胞株和表皮細胞株的構建包括以下步驟：（1）采樣:從雄性成年內蒙古白絨山羊個體的耳尖部取皮膚組織，用含雙抗的生理鹽水沖洗，然后去除附著在皮膚上的脂肪和結締組織基膜層，露出真皮層后，置于70?75%酒精中浸泡約45?60s后，再用含雙抗的PBS洗滌，置于含雙抗的DMEM/F12培養液中，剪碎；（2）內蒙古白絨山羊耳部皮膚組織原代培養:將皮膚組織塊均勻接種在培養瓶的瓶壁，加入含胎牛血清、表皮細胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養液，擰緊瓶蓋，以組織塊在上、培養液在下的方式放入培養箱，靜置3～4h后，輕輕將培養瓶翻轉，使培養液浸沒組織塊，在培養箱內靜置培養，每2?4d更換一次新鮮培養液，培養11?17d后，得到皮膚成纖維細胞與上皮細胞的混合原代細胞培養物；（3）皮膚成纖維細胞與上皮細胞的分離與純化：將步驟（2）所得混合原代細胞培養物用PBS清洗，再用1?2mL含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的D?Hanks液消化，至大部分細胞回縮及有少量細胞漂起后，立即終止消化，用移液槍吹打使細胞懸浮，吸取細胞懸液離心棄上清后，接種入新的培養瓶中，放入培養箱培養，通過2～3次選擇傳代，得純化的皮膚成纖維細胞株；吸取所述細胞懸液后的培養瓶用PBS洗滌，加入含胎牛血清、表皮細胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養液繼續放入培養箱培養，待表皮細胞長滿瓶底時，消化傳代，通過2～3次選擇傳代，得純化的表皮細胞株。...
【技術特征摘要】
1.一種同時分離內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和表皮細胞的原代培養方法，其特征在于皮膚成纖維細胞株和表皮細胞株的構建包括以下步驟 (1)采樣從雄性成年內蒙古白絨山羊個體的耳尖部取皮膚組織，用含雙抗的生理鹽水沖洗，然后去除附著在皮膚上的脂肪和結締組織基膜層，露出真皮層后，置于70-75%酒精中浸泡約45-60s后，再用含雙抗的PBS洗滌，置于含雙抗的DMEM/F12培養液中，剪碎； (2)內蒙古白絨山羊耳部皮膚組織原代培養將皮膚組織塊均勻接種在培養瓶的瓶壁，加入含胎牛血清、表皮細胞生長因子和雙抗的DMEM/F12培養液，擰緊瓶蓋，以組織塊在上、培養液在下的方式放入培養箱，靜置3 4h后，輕輕將培養瓶翻轉，使培養液浸沒組織塊，在培養箱內靜置培養，每2-4d更換一次新鮮培養液,培養ll-17d后,得到皮膚成纖維細胞與上皮細胞的混合原代細胞培養物； (3)皮膚成纖維細胞與上皮細胞的分離與純化將步驟(2)所得混合原代細胞培養物用PBS清洗，再用l-2mL含O. 25%胰蛋白酶和O. 02%EDTA的D-Hanks液消化，至大部分細胞回縮及有少量細胞漂起后，立即終止消化，用移液槍吹打使細胞懸浮，吸取細胞懸液離心棄上清后，接種入新的培養瓶中，放入培養箱培養，通過2 3次選擇傳代，得純化...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王志鋼，劉東軍，旭日干，
申請(專利權)人：內蒙古大學，
類型：發明
國別省市：
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