一種應用于標記開發的高通量測序的接頭及其運用方法技術

本發明專利技術基于illumina公司的Hiseq測序平臺提供的接頭序列和測序流程，設計了內切酶特異性的粘性末端序列接頭，成功的建立了DNA標簽文庫的建庫方法，并應用于Hiseq2000測序，開發分子標記，從而應用于群體遺傳學研究和遺傳圖譜的繪制。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及高通量測序領域，尤其涉及一種標記開發的高通量測序的接頭及其運用方法。
技術介紹
RAD (restriction association site DNA)是酶切位點附近的 DNA 序列標簽。 RAD可以作為一種分子標記應用于基因定位，圖譜繪制等。RAD標記的密度可以通過在分離的過程中應用不同的內切酶獲得。RAD標記技術與第二代測序技術的完美結合，能夠快速而且高通量的實現標記開發，圖譜繪制等。RAD標記技術能夠降低基因組的復雜度，不受基因組序列有無的限制，操作簡便，能夠快速的開發出大量的分子標記，從而廣泛應用于群體的遺傳研究。
技術實現思路
為了實現上述的技術目的，本專利技術提供了一種標記開發的高通量測序的接頭及其運用方法。本專利技術的一個目的是提供兩種特殊結構的接頭分子A和B。本專利技術提供的雙鏈接頭DNA序列分子A，包括正向和反向兩條鏈。正向鏈從5’末端到3’末端依次由如下部分組成與Illumina公司的Hiseq2000測序平臺測序序列P7相同的寡核苷酸片段和與待測DNA的3’端互補的粘性酶切位點序列；反向鏈與正向鏈除了突出的粘性末端外，其余序列與正向鏈互補，并在5’末端進行磷酸化修飾。接頭A的結構如圖I所示。前述的提供的雙鏈接頭DNA序列分子A，其中所述的正向鏈為序列表中序列I。前述的提供的雙鏈接頭DNA序列分子A，其中所述的與illumina公司的 Hiseq2000測序平臺測序序列p7相同的寡核苷酸片段，為序列表中序列I的第5_61位。前述的提供的雙鏈接頭DNA序列分子A，其中所述的與待測DNA的3’端互補的粘性酶切位點序列，為序列表中序列I的第1-4位。前述的提供的雙鏈接頭DNA序列分子A，其中所述的反向鏈為序列表中序列2。前述的提供的雙鏈接頭DNA序列分子A，其中所述的在反向鏈5’末端進行磷酸化修飾，為序列表中序列I的第I位的脫氧核糖核苷酸進行的磷酸化修飾。本專利技術提供的局部雙鏈的接頭DNA序列分子B，包括一個長的正向鏈和一個短的反向鏈。正向鏈從5’末端到3’末端依次由如下部分組成 與Illumina公司的測序平臺測序序列P5相同的寡核苷酸片段和與待測DNA的3’端互補的一個脫氧核糖核苷酸突出末端；反向鏈與正向鏈的一部分序列互補并在5’末端進行磷酸化修飾。接頭B的結構如圖2 所示。前述的提供的局部雙鏈的接頭DNA序列分子B，其中所述的正向鏈為序列表中序列3。前述的提供的局部雙鏈的接頭DNA序列分子B，其中所述的與Illumina公司的測序平臺測序序列P5相同的寡核苷酸片段，為序列表中序列3的第1-57位。前述的提供的局部雙鏈的接頭DNA序列分子B，其中所述的與待測DNA的3’端互補的一個脫氧核糖核苷酸為序列表中序列3的第58位。前述的提供的局部雙鏈的接頭DNA序列分子B，其中所述的反向鏈為序列表中序列4。前述的提供的局部雙鏈的接頭DNA序列分子B，其中所述的在反向鏈5’末端進行磷酸化修飾，為序列表中序列4的第I位的脫氧核糖核苷酸進行的磷酸化修飾。本專利技術的第二個目的是提供一種運用上述接頭A和B進行高通量測序開發分子標記的方法，包括如下步驟I)將所述用于標記開發的基因組DNA用特定的限制性內切酶消化，并將所述的接頭A與消化產物連接，得到含有接頭A的連接產物；2)對步驟I)得到的連接產物進行打碎，打碎大小集中在300— 700bp之間；3)對步驟2)得到的打碎產物純化回收之后，進行末端補平，加dATP，并進行接頭B的連接；4)對步驟3)得到的連接產物進行純化并定量后進行PCR擴增，并將擴增產物純化后，在Illumina公司的Hiseq2000測序平臺進行測序；5)進行生物信息分析后，確定酶切位點SNP或INDEL等標記。流程圖如圖3所/Jn ο前述的一種運用上述接頭A和B進行高通量測序開發分子標記的方法，步驟I)中， 所述將基因組DNA消化的酶切體系包括酶切緩沖液、限制性內切酶、O. I-Iug的基因組 DNA，所述限制性內切酶在酶切體系中的濃度為O. 5 U/ul ;所述的連接體系包括上述酶切產物、接頭A、ATP、連接酶，所述的接頭A的濃度為ΙΟΟηΜ，所述的ATP的濃度為ImM，所述連接酶在所述連接體系中的濃度為O. 5 U/ul。前述的一種運用上述接頭A和B進行高通量測序開發分子標記的方法，步驟2)中， 所述的打碎的條件為使用covaris打碎儀器并調整相應的參數。前述的一種運用上述接頭A和B進行高通量測序開發分子標記的方法，步驟3)中， 所述的回收打碎產物的方法為采用PCR產物回收試劑盒進行回收；所述的末端補平體系為使用NEB公司的Quick Blunting kit進行；所述的加dATP的體系包括dATP,加A緩沖液，加dATP的聚合酶，所述的dATP的濃度為5 mM,所述的聚合酶在所述的反應體系中的濃度為O. 05 U/ul ;所述的接頭B的連接體系包括接頭B，ATP、連接酶，所述的接頭B的濃度為10 uM，所述的ATP的濃度為ImM，所述連接酶在所述連接體系中的濃度為O. 5 U/ul。前述的一種運用上述接頭A和B進行高通量測序開發分子標記的方法，步驟4)中， 所述的PCR體系包括引物，聚合酶混合物，以及步驟3)中得到的連接產物。所述的引物的濃度為O. 2 uM，所述聚合酶混合物在所述PCR體系中所占的50%的體積。前述的一種運用上述接頭A和B進行高通量測序開發分子標記的方法，其中所述的基因組DNA為任何單倍體或二倍體材料的DNA，包括動物、植物、微生物等。本專利技術的實驗證明，本專利技術提供的接頭分子A和B，能夠連接到DNA片段的兩端，運用本專利技術的建庫方法，成功的構建了 DNA文庫,并成功的運用在illumina公司的Hiseq2000 的測序平臺進行測序，獲得大量的分子標記位點；同時，可以實現多個樣本的混合建庫，根據需要調整獲取的分子標記的數目。本專利技術提供了一種便捷，高效，快速的標記開發的方法，在居群遺傳、圖譜繪制、種質評價和鑒定等研究和應用領域有著廣泛的應用前景。附圖說明圖I為接頭A的結構示意圖；圖2為接頭B的結構示意圖；圖3為建庫流程示意圖；圖4為所述材料基因組DNA酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5為對酶切基因組DNA產物加上接頭A之后的打碎產物的瓊脂糖凝膠電泳圖(切膠回收前后);圖6為對加上接頭B的連接產物進行PCR擴增產物的電泳圖。具體實施方式下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本專利技術。下述實施例中所述方法如無特別說明均為常規方法，所用核苷酸序列均由上海 Invitrogen生物公司合成。所用試劑如無特別說明均為NEB公司的產品,所用水均為超純水。I、基因組DNA的酶切和接頭A的連接。I)樣品濃度測定使用Qubit (美國)對樣品DNA濃度測定，進行精準定量，并使用O. 8%瓊脂糖凝膠，120v電壓，電泳I小時，檢測樣品質量，確保水稻基因組DNA樣品完整無降解。2)以步驟I)檢測的水稻基因組DNAlOOngIug為模板進行限制性酶切。反應體系和反應條件如下樣品 DNA (150 250 ng/ μ I) O. 1-1 μ g , Restriction Enzyme {EcoRl)Iμ 1，10XNEB Buffer 2 5 μ 1，補加H2O至總體積為50 μ 1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種接頭序列A，其特征在于，是如下1）或2）的核苷酸：1）由序列表中序列1和2所示的核苷酸序列組成的接頭；2）將序列表中序列2的核苷酸殘基序列經過一個或幾個堿基的取代和/或缺失和/或添加且具與接頭A同樣功能的核苷酸序列。

【技術特征摘要】
1.一種接頭序列A，其特征在于，是如下I)或2)的核苷酸 1)由序列表中序列I和2所示的核苷酸序列組成的接頭； 2)將序列表中序列2的核苷酸殘基序列經過一個或幾個堿基的取代和/或缺失和/或添加且具與接頭A同樣功能的核苷酸序列。2.一種接頭序列B，其特征在于，是如下I)或2)的核苷酸 1)由序列表中序列3和4所示的核苷酸序列組成的接頭； 2)將序列表中序列4的核苷酸殘基序列經過...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣智，劉少卿，彭獻軍，吳靜，
申請(專利權)人：北京諾禾致源生物信息科技有限公司，
類型：發明
國別省市：