5聚體CRP的制造方法、制造5聚體CRP的基因重組蠶及其制造方法、編碼單體狗CRP的DNA及含該DNA的表達載體技術

將編碼單體CRP的DNA導入蠶而制成基因重組蠶，接下來，回收由制成的基因重組蠶制造的5聚體CRP，純化，從而以高效率制造5聚體CRP。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】5聚體CRP的制造方法、制造5聚體CRP的基因重組蠶及其制造方法、編碼單體狗CRP的DNA及含該DNA的表達載體
本專利技術涉及使用蠶的5聚體CRP (C-Reactive Protein ；C反應性蛋白質)的制造方法。本專利技術還涉及制造5聚體CRP的基因重組蠶及其制造方法。本專利技術另外涉及編碼單體狗CRP的DNA及含該DNA的表達載體。
技術介紹
CRP是在5個單體CRP非共有結合性地結合而形成的5聚體CRP的狀態下有活性的蛋白質。在活體內，幾乎全部CRP作為5聚體CRP存在。再有，在以下本說明書中，在不特別指定的場合，CRP是指5聚體CRP。在臨床檢查領域中，CRP是在急性炎癥或急性的組織崩解中增加的急性期蛋白質之一種，已知是代表性的炎癥標志物。CRP的定量在看引起炎癥一組織障礙的各種的疾病的活動性一重癥度一經過之時不可或缺。從而，在醫院、臨床檢查中心等中，CRP被常規測定。在此時使用的CRP測定試劑盒中，多含標準CRP溶液，每日消費大量的CRP。因此，要求高純度并且廉價的CRP的制造。為了制造高純度的CRP，檢查基因工程學的方法的利用。作為基因工程學的CRP的制造方法，唯一商業上實現的是以大腸桿菌作為宿主的(專利文獻I)。現有技術文獻專利文獻專利文獻I:美國專利第5702921號說明書
技術實現思路
專利技術要解決的技術課題為了使用基因工程學的方法制造高純度且相比并且現狀更廉價的CRP，有在升高宿主的產生CRP的效率的同時，降低宿主產生的CRP的回收所要求的成本的必要。為了實現這些，不得不探索相比以往的宿主更適宜CRP的制造的宿主。S卩，在專利文獻I中記載的以大腸桿菌作為宿主的CRP的制造方法中，由kil基因的作用而在原本并周質區域中蓄積的CRP分泌到菌體外。通過CRP分泌到培養基中，使CRP的純化變得容易，以圖CRP回收的成本降低。但是，過量表達kil基因的菌株一般不適宜高密度培養(Yoon, S. H. et al.，Recent Pat. Biotechnol.，4，23-29，2010)。因此，用于得高純度的CRP的濃縮一純化作業變得煩瑣，實現產生CRP的效率的進一步升高困難。鑒于此實狀，本專利技術的課題是提供可以高效率制造5聚體CRP的新的5聚體CRP的制造方法、適宜5聚體CRP的制造的基因重組蠶及其制造方法、編碼單體狗CRP的DNA及含該DNA的表達載體。解決課題的技術方案本專利技術人為了解決上述的課題而銳意研究的結果，令人驚訝地發現，在不共表達如促進分泌的kil基因等，并且維持由非共有結合形成的5聚體結構和活性的狀態下，使基因重組蠶表達分泌5聚體CRP而以高效率制造，另外，可從基因重組蠶容易地回收制造的5聚體CRP，從而完成本專利技術。從而，本專利技術涉及以下的 所列舉的，5聚體CRP的制造方法、制造5聚體CRP的基因重組蠶及其制造方法、編碼單體狗CRP的DNA及含該DNA的表達載體。 5聚體CRP的制造方法，其具有制成導入了編碼單體CRP的DNA的基因重組蠶的制成步驟，以及回收由制成的基因重組蠶制造的5聚體CRP的回收步驟。 所述的制造方法，其中上述制成步驟是導入下列DNA的制成基因重組蠶的步驟編碼轉錄因子的DNA，所述轉錄因子與編碼絹絲腺特異性地表達的蛋白質的DNA的啟動子的下游功能性地結合；和編碼單體CRP的DNA，所述單體CRP與該轉錄因子的目標啟動子的下游功能性地結合。 所述的制造方法，其中上述制成步驟是使下列蠶交配而制成基因重組蠶的 步驟導入編碼轉錄因子的DNA的蠶，所述轉錄因子與編碼絹絲腺特異性地表達的蛋白質的DNA的啟動子的下游功能性地結合，和導入編碼單體CRP的DNA的蠶，所述單體CRP與該轉錄因子的目標啟動子的下游功能性地結合。 或所述的制造方法,其中上述轉錄因子是GAL4,目標啟動子是UAS。 之任一項所述的制造方法，其中上述回收步驟是制成的基因重組蠶回收其絹絲腺中制造的5聚體CRP的步驟。 之任一項所述的制造方法，其中上述CRP是狗CRP。 之任一項所述的制造方法，上述編碼單體CRP的DNA是編碼含SEQID NO: I所示的序列的氨基酸序列的DNA。 之任一項所述的制造方法，其中上述編碼單體CRP的DNA是含SEQID NO: 4所不的喊基序列的DNA。基因重組蠶，其導入有編碼單體CRP的DNA，且制造5聚體CRP。基因重組蠶，其導入有編碼轉錄因子的DNA，所述轉錄因子與編碼絹絲腺特異性地表達的蛋白質的DNA的啟動子的下游功能性地結合、和編碼單體CRP的DNA，所述單體CRP與該轉錄因子的目標啟動子的下游功能性地結合，在絹絲腺中制造5聚體CRP。 所述的基因重組蠶,上述轉錄因子是GAL4,目標啟動子是UAS。 之任一項所述的基因重組蠶，其中上述CRP是狗CRP。 之任一項所述的基因重組蠶，其中上述編碼單體CRP的DNA是編碼含SEQ ID NO: I所示的序列的氨基酸序列的DNA。 之任一項所述的基因重組蠶，其中上述編碼單體CRP的DNA是含SEQ ID N0:4所示的堿基序列的DNA。制造5聚體CRP的基因重組蠶的制造方法，其包括將編碼單體CRP的DNA導入蠶的導入步驟。在絹絲腺中制造5聚體CRP的基因重組蠶的制造方法，其包括將下列DNA導入蠶的導入步驟編碼轉錄因子的DNA，所述轉錄因子與編碼絹絲腺特異性地表達的蛋白質的DNA的啟動子的下游功能性地結合，和編碼單體CRP的DNA，所述單體CRP與該轉錄因子的目標啟動子的下游功能性地結合。 所述的制造方法，其中上述導入步驟是使下列蠶交配而制成導入DNA的蠶的步驟導入編碼轉錄因子的DNA的蠶，所述轉錄因子與編碼絹絲腺特異性地表達的蛋白質的DNA的啟動子的下游功能性地結合，和導入編碼單體CRP的DNA的蠶，所述單體CRP與該轉錄因子的目標啟動子的下游功能性地結合。或所述的制造方法，其中上述轉錄因子是GAL4，目標啟動子是UAS。 之任一項所述的制造方法，其中上述CRP是狗CRP。 之任一項所述的制造方法，其中上述編碼單體CRP的DNA是編碼含SEQ ID NO: I所示的序列的氨基酸序列的DNA。 之任一項所述的制造方法，上述編碼單體CRP的DNA是含SEQID NO: 4所不的喊基序列的DNA。編碼單體狗CRP的DNA，其為編碼具有編碼含SEQ IDNO: I所示的序列的氨基酸序列的堿基序列的單體狗CRP的DNA。 所述的編碼單體狗CRP的DNA，其中上述堿基序列是含SEQ ID NO:4所示的序列的堿基序列。表達載體，其為具有或所述的編碼單體狗CRP的DNA的堿基序列的表達載體。 所述的表達載體，其中上述堿基序列與UAS的下游功能性地結合。再有，在本專利技術中，5聚體CRP是指5個單體CRP非共有結合性地結合而形成的5聚體，在活體內有活性。其中，在活體內有活性是指，優選為，作為在臨床檢查領域中利用的CRP測定試劑盒中含的校準物，另外，在制成CRP測定試劑盒中含的抗CRP抗體之時，作為抗原，可與血清來源的CRP同樣地發揮功能而使用。另外，本專利技術中“與啟動子的下游功能性地結合的”是指啟動子與DNA結合至通過轉錄因子結合到啟動子，在啟動子的下游存在的DNA的表達被誘導。其中，即便是DNA與其他基因結合，形成與其他基本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：清川嚴，有松祐治，三浦俊英，小島良，瀨筒秀樹，內野惠郎，小林功，田村俊樹，
申請(專利權)人：日東紡績株式會社，獨立行政法人農業生物資源研究所，
類型：
國別省市：