本發明專利技術公開了一種模擬骨髓間充質干細胞移植體外模型的構建方法，含以下步驟：(1)選取離體乳鼠皮層神經元；(2)選取離體大鼠骨髓間充質干細胞；(3)將大鼠骨髓間充質干細胞經預處理后，接種于乳鼠皮層神經元中進行共培養；(4)將共培養后的大鼠骨髓間充質干細胞和乳鼠皮層神經元經光鏡、熒光顯微鏡、原子力顯微鏡及掃描電鏡，確立模擬骨髓間充質干細胞移植的體外模型以及在超微結構上確定皮層神經元與骨髓間充質干細胞之間生長趨勢、相互作用及突觸樣結構的形成。其為間充質干細胞移植提供了一個簡化的體外模型，同時此模型中所形成的突觸樣結構為間充質干細胞損傷機制提供了結構整合機制的體外證據。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及。
技術介紹
近年來，骨髓間充質干細胞，作為移植治療中樞神經系統疾病的種子細胞之一，在基礎實驗與臨床試驗均得到了廣泛的研究和關注。就當前的研究而言，骨髓間充質干細胞參與修復中樞神經系統疾病的機制主要包括細胞替代，因子分泌，促血管生成等。為了進一步探索骨髓間充質干細胞與中樞神經系統中神經元之間的相互作用，并達到最簡化的模型來對骨髓間充質干細胞修復中樞神經系統疾病機制的精確探索，那么將體內移植的實驗轉移到體外并模擬構建體外移植模型即將皮層神經元與骨髓間充質干細胞行共培養，以 觀察兩種細胞間的相互作用為基礎，為后續眾多研究提供研究方法，實驗工具和深入研究的基礎。目前，還未有單位或者個人進行這個方面的研究。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供，該方法通過將皮層神經元與骨髓間充質干細胞行共培養，觀察兩種細胞間的相互作用，建立一種模擬骨髓間充質干細胞移植的體外模型，并能觀察到細胞間突觸樣結構的形成。本專利技術的上述技術問題是通過如下技術方案來實現的，含以下步驟(I)選取離體乳鼠皮層神經元，經培養鑒定后待用；(2)選取離體大鼠骨髓間充質干細胞，經培養鑒定后待用；(3)將大鼠骨髓間充質干細胞經預處理后，接種于步驟(I)的乳鼠皮層神經元中進行共培養，接種密度為1. 0-5. OX IO4個/cm2，共培養時間為4飛天；(4)將共培養后的大鼠骨髓間充質干細胞和乳鼠皮層神經元經光鏡、熒光顯微鏡、原子力顯微鏡及掃描電鏡檢測，確立模擬骨髓間充質干細胞移植的體外模型建立，并在超微結構上鑒定確定皮層神經元與骨髓間充質干細胞之間突觸樣結構的形成。本專利技術步驟(I)中離體乳鼠皮層神經元優選通過免疫熒光法來鑒定乳鼠皮層神經元。本專利技術步驟(2)中大鼠骨髓間充質干細胞優選采用流式法進行鑒定。本專利技術步驟(3)中大鼠骨髓間充質干細胞預處理時優選為取步驟(2)中的大鼠骨髓間充質干細胞，經胰酶消化，離心后，再經DMEM/F12培養基、2%B-27和2%胎牛血清重懸處理大鼠骨髓間充質干細胞即可。本專利技術具有如下優點(I)本專利技術為間充質干細胞移植提供了一個簡化的體外模型，在此模型的基礎上，可以繼續深入的進行大量的基礎研究，比如進行基因敲除來鑒定某些基因、小RNA及藥物在移植過程中發揮的作用，為進一步研究間充質干細胞移植修復損傷的機制提供了很簡化且很好的平臺；(2)本專利技術模擬的體外模型中所形成的突觸樣結構為間充質干細胞損傷機制提供了結構整合機制的體外證據；(3)本專利技術模擬的體外模型，比起體內試驗，能夠更精確的反應修復過程中其決定性作用的因素，避免了體內微環境中復雜成分的干擾。附圖說明圖1是實施例1中出生3天內wistar乳鼠皮層神經元培養4天，低倍倒置相差顯 微鏡 bar=100 μ m ；圖2是實施例1中出生3天內wistar乳鼠皮層神經元培養4天，高倍倒置相差顯微鏡 bar=100 μ m ；圖3是實施例1中出生3天內wistar乳鼠皮層神經元培養4天抗MAP2蛋白陽性，熒光顯微鏡bar=100 μ m ；圖4是實施例1中出生3天內wistar乳鼠皮層神經元培養4天抗β-tubulin蛋白陽性，熒光顯微鏡bar=100 μ m ；圖5是實施例1中100_150g Wistar大鼠骨髓間充質干細胞第二代培養4天，低倍倒置相差顯微鏡bar=100 μ m ；圖6是實施例1中100_150g Wistar大鼠骨髓間充質干細胞第二代培養4天，高倍倒置相差顯微鏡bar=100 μ m ；圖7是實施例1中100_150g Wistar大鼠骨髓間充質干細胞第二代培養4天FITC同型對照陰性，流式細胞儀；圖8是實施例1中100_150g Wistar大鼠骨髓間充質干細胞第二代培養4天CD34表達陰性，流式細胞儀；圖9是實施例1中100_150g Wistar大鼠骨髓間充質干細胞第二代培養4天CD29表達陽性，流式細胞儀；圖10是實施例1中100_150g Wistar大鼠骨髓間充質干細胞第二代培養4天CD90表達陽性，流式細胞儀；圖11是實施例1中共培養體系建立6天神經元軸突呈朝向骨髓間充質干細胞遷移趨勢，低倍倒置相差顯微鏡bar=100 μ m ；圖12是實施例1中共培養體系建立6天在共培養體系中神經元軸突呈沿著骨髓間充質干細胞表面或間隙遷移趨勢，高倍倒置相差顯微鏡bar=100 μ m ；圖13是實施例2中共培養體系建立6天神經元軸突呈朝向骨髓間充質干細胞遷移趨勢，熒光顯微鏡bar=100 μ m ；圖14是實施例2中共培養體系建立6天神經元軸突呈沿著骨髓間充質干細胞表面或者間隙遷移趨勢(紅色為神經元特異性表達蛋白β-tubulin)，熒光顯微鏡bar=100μ m ；圖15是實施例2中共培養體系建立6天神經元軸突呈朝向骨髓間充質干細胞迀移趨勢，原子力顯微鏡；圖16是實施例2中共培養體系建立面或間隙遷移趨勢，原子力顯微鏡；圖17是實施例2中共培養體系建立類突觸結構形成三圍成像，原子力顯微鏡；圖18是實施例2中共培養體系建立類突觸結構形成的放大圖，原子力顯微鏡；圖19是實施例2中共培養體系建立移趨勢，掃描電鏡XO. 5K;圖20是實施例2中共培養體系建立 面或間隙遷移趨勢，掃描電鏡XO. 5K ;圖21是實施例2中共培養體系建立類突觸結構形成，掃描電鏡X5K;圖22是實施例2中共培養體系建立類突觸結構形成，掃描電鏡XlOK ；圖23是實施例2中共培養體系建立類突觸結構形成，掃描電鏡X5K;圖24是實施例2中共培養體系建立類突觸結構形成，掃描電鏡XlOK ;圖25是本專利技術試實驗流程圖。6天神經元軸突呈沿著骨髓間充質干細胞表6天后皮層神經元與骨髓間充質干細胞之間6天后皮層神經元與骨髓間充質干細胞之間6天神經元軸突呈朝向骨髓間充質干細胞遷6天神經元軸突呈沿著骨髓間充質干細胞表6天后皮層神經元與骨髓間充質干細胞之間6天后皮層神經元與骨髓間充質干細胞之間6天后皮層神經元與骨髓間充質干細胞之間6天后皮層神經元與骨髓間充質干細胞之間具體實施例方式以下結合實施例和對比對本專利技術進行闡述，然而本專利技術的保護范圍并非僅僅局限于以下實施例。所屬
的普通技術人員依據本專利技術公開的內容，均可實現本專利技術的目的。以下就本專利技術的發酵培養說明。實施例1模擬骨髓間充質干細胞移植的體外模型建立的方法(一)皮層神經元的獲取與培養動物選擇出生3天以內的wistar近交系乳鼠I只；在冰上操作，斷頭，剝離乳鼠顱骨，暴露腦組織，使用顯微器械分離出置于裝有冷的DMEMF12培養基的培養皿中的大腦皮層；將大腦皮層轉移到無菌青霉素瓶中，并剪成約ImmX ImmX Imm大小的碎片，往瓶內加入O. 015g/mL木瓜蛋白酶400 μ L, 50mM乙二胺四乙酸(EDTA) 60 μ L, lmg/mL半胱氨酸200 μ L和5. 34ml DMEM/F12培養基搖勻于37°C培養箱中消化10分鐘。胰酶抑制劑終止消化，使用吸管適當的吹散皮層，過濾，取濾液，離心；用DMEM/F12培養基與2%B_27將離心所得細胞團塊重懸，并以4. OX IO4個/cm2接種于預先使用多聚左旋賴氨酸過夜鋪板的24孔板內培養。(二)皮層神經元的鑒定由于微管相關蛋白-2 (MAP2)蛋白和β-tubullin蛋白均為皮本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種模擬骨髓間充質干細胞移植體外模型的構建方法，其特征是含以下步驟：(1)選取離體乳鼠皮層神經元，經培養鑒定后待用；(2)選取離體大鼠骨髓間充質干細胞，經培養鑒定后待用；(3)將大鼠骨髓間充質干細胞經預處理后，接種于步驟(1)的乳鼠皮層神經元中進行共培養，接種密度為1.0?5.0×104個/cm2，共培養時間為4~6天；(4)將共培養后的大鼠骨髓間充質干細胞和乳鼠皮層神經元經光鏡、熒光顯微鏡、原子力顯微鏡及掃描電鏡檢測，確立模擬骨髓間充質干細胞移植的體外模型建立，并在超微結構上鑒定確定皮層神經元與骨髓間充質干細胞之間突觸樣結構的形成。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：姜曉丹，李鵬，法志強，張潤，孫海濤，劉翼，
申請(專利權)人：姜曉丹，李鵬，
類型：發明
國別省市：
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