一種神經元分離和培養的改進型方法技術

一種神經元分離和培養的改進型方法，含有大腦皮質組織分離、組織細胞搗碎后胰酶消化、篩網過濾離心、細胞原代培養等4個實驗步驟。此外還可包含神經元鑒定的步驟。本發明專利技術的目的在于針對現有技術存在的問題，改進當前體外分離和培養神經元的方法，使之簡單易行，培養獲得的神經元生長良好，純度高，產量大，可滿足神經科學研究中細胞生物學實驗的需求。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于動物細胞培養
，具體涉及一種神經元體外分離和培養方法。研究背景神經元，又稱神經細胞，是構成神經系統結構和功能的基本單位。神經元是具有長突起的細胞，它由細胞體和細胞突起構成。在長的軸突上套有一層鞘，組成神經纖維，它的末端的細小分支叫做神經末梢。細胞體位于腦、脊髓和神經節中，細胞突起可延伸至全身各器官和組織中。細胞體是細胞含核的部分，其形狀大小有很大差別，直徑約4 120微米。核大而圓，位于細胞中央，染色質少，核仁明顯。細胞質內有斑塊狀的核外染色質(舊稱尼爾小體)，還有許多神經元纖維。細胞突起是由細胞體延伸出來的細長部分，又可分為樹突和軸突。每個神經元可以有一或多個樹突，可以接受刺激并將興奮傳入細胞體。每個神經元只有一個軸突，可以把興奮從胞體傳送到另一個神經元或其他組織，如肌肉或腺體。在神經系統發育過程中，中樞神經系統經歷了細胞數量和體積的增長及細胞連接形成改變過程。分化的神經元一經產生，便不可能再進行分裂，神經元的正常分化過程一旦受損，即有可能影響突觸聯系的正常建立等一系列過程。對神經元損傷的機制及其防治， 一直是人們感興趣的問題。隨著對神經元功能的了解，它已逐漸成為神經生物學領域研究的熱點。但由于在體內神經元與其它神經細胞以及其他組織細胞混雜存在，妨礙了其生物學功能的研究及應用。因此需要對神經元進行體外培養并純化，才能深入了解其形態結構和生物學功能。由于神經元是一種高度分化的細胞，動物出生后很少分裂增殖，相對于其它細胞而言，神經元在體外更難以 存活和生長，其胞體伸出許多又長又細的突起，在取材過程中容易損傷其突起。在胚胎發育過程中，神經系統發育較早。出生后，神經系統發育基本完成， 很多神經元此時已經長出突起，取材于該時期的腦組織對神經元的損傷較大。胚胎時期的神經元分化程度較低，體外生存能力強，該時期神經元之間的聯系較少，取材過程中造成的不可逆傷害較小，易于成功培養。體外培養神經元要求的培養方法和營養條件均較為特殊。目前神經元的培養分為有血清培養和無血清培養，有血清培養提供細胞培養所必須的營養成分，促進細胞增殖和 DNA的合成，但也為神經膠質細胞、成纖維細胞、神經干細胞等其它神經細胞提供了豐富的營養，但也使得培養的神經元很難分離開。無血清培養技術不利于有絲分裂細胞的生長，可防止非神經元過度增殖，可提高培養的神經元純度。采用無血清培養能通過添加某些成分， 而且可選擇性地促進和控制神經元的生長。目前尚未見有關神經元體外分離或培養方法的專利文獻公開，雖然神經元采用常規細胞培養技術，能夠在一定程度上達到培養的目的，但存在著與神經膠質細胞，成纖維細胞等其它雜細胞很難分離以及體外培養存活困難等問題，不能滿足細胞實驗的要求。本室參照國內外培養分離神經元的方法。根據多年的實驗研究，改進了大腦皮質神經元的體外培養方法，建立了一種穩定、可靠的獲得神經元的方法，為了解神經元的結構與功能，闡明其在腦血管疾病、神經系統疾病中的作用研究提供成功的實驗模型。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有技術存在的問題，改進當前體外分離和培養神經元的方法，使之簡單易行，培養獲得的神經元生長良好，純度高，產量大，可滿足神經科學研究中細胞生物學實驗的需求。采用以下方案來實現本專利技術的目的。一種體外分離和培養神經元的方法，含有大腦皮質組織分離、組織細胞搗碎后胰酶消化、篩網過濾離心、細胞原代培養等4個實驗步驟。此外還可包含神經元鑒定的步驟。大腦皮質組織分離孕鼠頸椎脫白致死，無菌條件下取出胚胎，然后在無菌條件下取胎鼠兩側大腦半球放入培養皿中，剝離并去除皮層血管組織和軟腦膜。優選方案為孕15-17天的大鼠頸椎脫臼致死，75%乙醇腹部消毒，剪刀剪開腹部至兩側，無菌條件下取出串珠狀胚胎，放入盛有IXPBS的培養皿中，然后在無菌超凈臺內冰床上取胎鼠兩側大腦半球放入盛有IXPBS的培養皿中，用眼科鑷夾取動物雙側大腦皮質置于盛有IXPBS的培養皿內，仔細剝離并去除皮層血管組織和軟腦膜，再將大腦皮質移至另一個盛有IXPBS的培養皿內。需要注意的是解剖過程一定要全程在冰上進行。目的在于從你處死母鼠后，胎鼠的大腦的溫度要最快的降低到O度，有助于提高神經元的存活率。另外，在解剖過程中，胎鼠直到皮層或海馬被剪碎的過程，有時候可能需要2小時，如果樣品多。一定要注意多準備冰袋子。確保你的任何過程都在冰浴的培養液中進行(消化步驟除外)。這樣可以大大提高神經元細胞的存活率。在解剖大腦時候，有人用hank’s液，在其中解剖。但即使 是O度，神經元還是在進行著很大程度代謝。所以，hank’s液的無糖環境很不利。建議使用DMEM-高糖或DMEM-F12與馬血清來浸泡解剖過程中的大腦，來供給大腦的代謝，血清可以抑制神經凋亡。這其中還有一個問題，就是DMEM培養液會在空氣中變堿性。國外有的實驗室用L-15 培養液來浸泡解剖過程中的腦，因為L-15不會再空氣中變堿性。組織細胞搗碎后胰酶消化無菌條件下，搗碎腦組織呈糜狀，然后加入低濃度的胰酶，置37°C培養箱消化5-30分鐘。然后用神經元培養首液終止消化，并繼續加入首液輕輕吹打，直至將組織全部吹散，形成細胞懸液。優選方案為無菌條件下，用眼科鑷夾碎腦組織呈糜狀，加入濃度O. 1-0. 125%胰酶2ml，37°C培養箱消化10分鐘。用神經元培養首液終止消化后，繼續加入神經元培養首液輕輕吹打，直至將組織全部吹散，形成細胞懸液。需要注意的是除了采用胰酶以外，還可以采用木瓜酶聯合DNA酶的方法進行消化。木瓜酶是消化過后，存活率最高的酶。木瓜酶配成l_3mg/ml濃度進行消化，同時加入濃度為l_3mg/ml的DNA酶，加入量各l_2ml，消化時間為20-30分鐘。DNA酶的作用是，消化掉破裂細胞的DNA，避免了釋放的DNA和蛋白纏結在組織塊表面而阻礙進一步消化。木瓜酶和DNA酶在使用時需要現配現用。本方案提到的神經元培養首液配方為胎牛血清|ιο%_權利要求1.一種神經元分離和培養方法，其包括以下步驟大腦皮質組織分離；組織細胞搗碎后酶消化；篩網過濾并離心的步驟；以及細胞原代培養；其特征在于細胞原代培養的步驟為將已離心的上清液棄去，用2ml神經元培養首液重懸放入培養皿中，調整細胞密度為 5X 105個/ml，接種于預先用多聚賴氨酸包被的24孔或96孔培養板內進行培養；培養12小時后換液改用神經元培養維持液，首次全量換液；以后每2天換維持液I次,每次半量換液；細胞生長5天可進行鑒定，6天后用于實驗。2.根據權利要求1所述的一種神經元分離和培養方法，其特征在于首次全量換液體積為24孔板每次500 μ I/孔或96孔板100 μ I/孔。3.根據權利要求1-2所述的一種神經元分離和培養方法，其特征在于所述大腦皮質組織分離步驟為將孕15-17天的大鼠頸椎脫臼致死，75%乙醇腹部消毒，剪刀剪開腹部至兩側，無菌條件下取出串珠狀胚胎，放入盛有IXPBS的培養皿中，然后在無菌超凈臺內冰床上取胎鼠兩側大腦半球放入盛有IXPBS的培養皿中，用眼科鑷夾取動物雙側大腦皮質置于盛有 IXPBS的培養皿內，仔細剝離并去除皮層血管組織和軟腦膜，再將大腦皮質移至另一個盛有IXPBS的培養皿內。4.根據權利要求1-2所述的一種神經元分離和培養方法，其特征在于所述組本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種神經元分離和培養方法，其包括以下步驟：大腦皮質組織分離；組織細胞搗碎后酶消化；篩網過濾并離心的步驟；以及細胞原代培養；其特征在于：細胞原代培養的步驟為：將已離心的上清液棄去，用2ml神經元培養首液重懸放入培養皿中，調整細胞密度為5×105個/ml，接種于預先用多聚賴氨酸包被的24孔或96孔培養板內進行培養；培養12小時后換液改用神經元培養維持液，首次全量換液；以后每2天換維持液1次，每次半量換液；細胞生長5天可進行鑒定，6天后用于實驗。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃柏勝，鄔力祥，羅奇志，韓仰，羅潔，
申請(專利權)人：黃柏勝，
類型：發明
國別省市：