本發明專利技術涉及一種檢測TrkB受體816/817位酪氨酸位點激活水平的ELISA試劑盒，能在來自E17胚胎的大鼠原代皮層神經元細胞中定量檢測內源性TrkB受體受到其同親配體BDNF刺激后的激活水平。BDNF能誘導TrkB受體胞內段多個酪氨酸殘基發生磷酸化，該誘導具有時間依賴性和劑量依賴性。這一過程可在TrkB受體固定在包被后的96孔板后使用第816位氨基酸磷酸化的TrkB（在人源為第817位）抗體以及磷酸化的酪氨酸抗體（抗PY99泛用抗體）檢測。因此，本發明專利技術為在原代神經元培養物和腦組織中定量檢測內源性TrkB受體的激活水平提供了一個強大的工具。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于醫學生物
，涉及一種檢測TrkB受體816/817位酪氨酸位點活性的ELISA試劑盒及其使用方法。
技術介紹
腦源性神經營養因子(BDNF)是神經營養因子家族的成員，該家族包括神經生長因子(NGF)，NT-3, NT-4/5(Thoenen, 1991)。BDNF,如同其他神經營養因子，具有通過TrkB受體酪氨酸激酶通路影響神經元細胞的生物學活性(Huang et al. , 2008;Kaplan andMiller, 2000)。TrkB是腦中分布最廣泛的神經營養因子之一，且在大腦皮層，海馬，紋狀體，腦干中高度富集(Shelton et al.，1995)。BDNF結合到TrkB能觸發后者的二聚化，這一過程是通過順應性改變和酪氨酸殘基的自磷酸化實現的，其結果將導致包括促分裂素原活化 蛋白激酶(MAPK)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷脂酶C-gl (PLC-gl)在內的三條主要信號通路的激活。BDNF/TrkB信號通路在許多細胞過程如突觸可塑性和神經保護作用中扮演了關鍵性角色(Hennigan et al. , 2007;Nagappan and Lu, 2005)。例如,BDNF能保護海馬免受谷氨酸中毒且能拯救小腦神經元細胞的細胞程序性死亡(Leeds et al.，2005)。BDNF對參與多種神經變性性疾病的神經細胞，如參與外周感覺病變的感覺神經元(Lindsay，1996)，在帕金森氏病中缺失的黑質多巴胺能神經元及參與阿爾茲海默癥的基底前腦膽堿能神經元(Siegel and Chauhan, 2000),都具有神經營養作用，故而已經成為治療領域研究熱點之一。最近，越來越多的證據表明這些分子也參與到神經發生和抗抑郁藥物作用過程。抗抑郁藥物能誘導BDNF信使RNA (mRNA)的表達，以及TrkB的自磷酸化激活過程(Nibuya etal. , 1995; Saarelainen et al. , 2003),在小鼠強迫游泳實驗中，抗抑郁藥物對BDNF單等位基因激活小鼠(BDNF+/mice)，前腦BDNF特異性完全缺失小鼠，及表達顯性失活TrkB(trkB.Tl)小鼠的作用藥效降低(Monteggia et al. , 2004; Saarelainen et al.，2003)。因此，BDNF/TrkB在多種神經學過程都扮演了重要角色。Trk受體的激活導致在該受體胞內段10個進化保守的酪氨酸殘基中的若干發生磷酸化。其中3個(在人類是第670、674、675位酪氨酸)位于激酶結構域的激活環。這些殘基的磷酸化可以增強酪氨酸激酶的活性，這種增強是通過將這些帶負電荷的磷酸化酪氨酸殘基與其附近的堿性氨基酸殘基配對而實現的。更多的磷酸化酪氨酸可以提供能與含有多聚嘧啶串結合蛋白(PTB)結構域或肉瘤病毒編碼蛋白同源結構域2型(SH2)的蛋白結合的停泊位點。細胞內信號轉導事件能夠被這些受體蛋白激活，包括大鼠肉瘤蛋白(Ras)-快速生長纖維瘤蛋白(Raf) -MAPK，PI3K-Akt，磷脂酶C (PLC)-y-鈣離子(Ca2+)，核轉錄因子(NFkB),以及非典型蛋白激酶C信號通路。當前研究已經關注于一對磷酸化酪氨酸之間的相互作用。第490位和785位的酪氨酸是不在激酶激活結構域內的主要的磷酸化酪氨酸(Stephens et al. , 1994)。TrkA和TrkB的磷酸化位點都是各自對應保守的TrkA第490位酪氨酸對應TrkB第512位酪氨酸，TrkA第674/675位酪氨酸對應TrkB第706/707位酪氨酸，TrkA第785位酪氨酸對應第817位酪氨酸(人源，在小鼠是第816位)(Huang andReichardt, 2003)。目前檢測這些信號通路激活的方法中，各種針對TrkB受體特定磷酸化位點的抗體的免疫印跡法已經被廣泛應用。盡管定量ELISA檢測磷酸化的TrkB的試劑盒已經可以商業化購買，但是目前尚只有針對人源TrkB受體的產品。TrkB受體在許多腫瘤組織中高度表達，如神經母細胞瘤，前列腺癌和胰腺導管腺癌。在神經母細胞瘤中，當促腫瘤生存的自分泌循環信號通路被過度表達的BDNF所增強時，TrkB的高度表達與不利病情轉歸的出現息息相關。因此，這些方法還可以應用于檢測人癌細胞中TrkB的激活。不過，BDNF/TrkB信號通路主要還是在神經系統中扮演角色，內源性的TrkB受體也處在一個本底水平。所以研究上還是以大鼠或小鼠作為主要實驗對象。然而賽爾新羅公司(Cell Signaling)的ELISA產品并不能滿足這種需要。故而，我們建立了一種檢測TrkB受體816/817位酪氨酸位點激活水平的ELISA試劑盒，可以檢測出大鼠內源性TrkB的激活。考慮到不同物種蛋白存在同源性，該試劑盒可應用于人，小鼠和大鼠。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種檢測TrkB受體816/817位酪氨酸位點活 性的ELISA試劑盒。本專利技術的ELISA試劑盒包括以下組成第817位磷酸化的TrkB抗體包被的96孔板；PY-99 抗體，以 1:1000 稀釋于 2%BSA/PBST 溶液；辣根過氧化物酶體標記的抗鼠IgG 二抗，1:5000稀釋于2%BSA/PBST溶液。還包括TMB底物溶液，其為將Img TMB溶解于ImL 二甲基亞砜DMSO中，而后加入新鮮配制的9mL pH5. O的檸檬酸鹽緩沖液中，最后加入100 μ I 3%雙氧水H2O2 ； STOP終止溶液，成分為3N HCL ；洗脫緩沖液，其稀釋20倍后的終溶液為PBST溶液；樣品稀釋液，為2%BSA/PBST溶液加入2mM釩酸鈉；細胞裂解緩沖液，成分為IOOmM β甘油磷酸鈉，500mM Tris-鹽酸(pH 7. 4)，I. 5M氯化鈉，IOmM 乙二胺四乙酸二鈉 EDTA (pH 8. O)，10%Triton X-100, 20mM 釩酸鈉，500mM 氟化鈉，IOOmM焦磷酸鈉，1:10加入西格瑪公司出品的蛋白酶抑制劑混合物，稀釋10倍后使用。本專利技術的ELISA試劑盒使用方法如下將第817位磷酸化的TrkB抗體包被到96孔板中4攝氏度過夜，洗滌。包被后的平板使用2%牛血清白蛋白(BSA)封閉，充分洗滌后孵育以40 μ g溶解于樣品稀釋液中的細胞蛋白，這些細胞來自于經BDNF(100ng/ml)處理15分鐘的細胞培養物。平板在4攝氏度下緩速搖過夜，而后再次充分洗滌。接下來用抗PY99孵育平板，4攝氏度過夜。第2天洗滌平板后，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠二抗。用TMB作為底物檢測信號，因為TMB可被氧化為藍色溶液。顏色強度和顯色時間隨檢測的靈敏度和檢測條件不同而改變。當反應到達合適的顏色強度時，加入酸性的STOP終止溶液終止反應，溶液顏色將由藍色變為黃色。反應終止后一個小時內檢測結果可以維持穩定，平板應及時在450nm下用讀板器分析結果。此外，我們還檢測了在650nm的吸光度，這個數值代表平板和溶液本身的本底干擾，故而要用450nm的吸光度減去650nm的吸光度。本專利技術的ELISA試劑盒及ELISA方法，能定量分析TrkB在原代神經培養物中被激活的水平。我們驗證了 ELISA實驗的結果同使用磷酸化TrkB抗體進本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測TrkB受體816/817位酪氨酸位點活性的ELISA試劑盒，其特征在于，包括以下組成：第817位磷酸化的TrkB抗體包被的96孔板；PY？99抗體，以1:1000稀釋于2%BSA/PBST溶液；辣根過氧化物酶體標記的抗鼠IgG二抗，1:5000稀釋于2%BSA/PBST溶液。
【技術特征摘要】
1.一種檢測TrkB受體816/817位酪氨酸位點活性的ELISA試劑盒，其特征在于，包括以下組成 第817位磷酸化的TrkB抗體包被的96孔板； PY-99抗體，以1:1000稀釋于2%BSA/PBST溶液； 辣根過氧化物酶體標記的抗鼠IgG 二抗，1:5000稀釋于2%BSA/PBST溶液。2.根據權利要求I所述的ELISA試劑盒，其特征在于，還包括 TMB底物溶液，其為將Img TMB溶解于ImL 二甲基亞砜DMSO中，而后加入新鮮配制的9mL pH5. O的檸檬酸鹽緩沖液中，最后加入100 μ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：葉克強，
申請(專利權)人：武漢遠征世紀制藥有限公司，
類型：發明
國別省市：
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