基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法技術方案

本發明專利技術公開了基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法，特點是包括將0.1ng/ul的甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原按100ul/孔加于聚苯乙烯96孔反應板中進行預包被，并采用牛血清白蛋白封閉液進行封閉的步驟；將每孔加入倍比稀釋的甲魚系統性敗血癥球狀病毒卵黃抗體，并加入辣根過氧化酶標記的羊抗雞IgG和鄰苯二胺底物溶液顯色反應的步驟；最后在酶標儀上讀取各孔492nm波長處的吸光度值，測定孔吸光度值大于陰性對照孔均值2.1倍以上者判為陽性，優點是具有穩定性、特異性和靈敏度高、免疫干擾小、背景低等效果。

【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物制品制備技術及應用領域，尤其是涉及一種基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法。
技術介紹
甲魚，學名中華鱉，歷來是藥膳及滋補佳品。20世紀80年代，溫室養殖的興起，使原本奉為稀珍的甲魚的廣量大幅提聞，隨之而起的是疾病的肆意流行。2007年以來，在浙江地區，尤以杭州、寧波地區甲魚生態養殖場暴發一種系統性敗血癥，主要癥狀為系統性出血性敗血，研究人員經流行病學調查、組織切片與超薄切片觀察和人工感染試驗等研究，確定一種新型球狀病毒是其原發性致病因子，該新型球狀病毒為甲魚系統性敗血癥球狀病毒(Turtle systemic sepsis spherical virus TSSSV),該病毒具有較強的傳染性和高達 90-100%的致死性，而且這種疾病潛伏期較長，初期表現出來的病癥如白底板等容易和以往發現的一些細菌性疾病的病癥相似，容易造成誤診，貽誤治療時機，因此建立一種便捷、靈敏的病毒檢測方法頗為重要。目前，甲魚系統性敗血癥球狀病毒的實驗室診斷方法主要為RT-PCR方法，但該方法需要進行核酸的提取等步驟，樣品制備繁瑣，在檢測大批量樣品時容易發生交叉污染。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)具有操作簡單、敏感性、高快速、易標準化等優點，適合于大規模的樣品檢測。雞卵黃免疫球蛋白G抗體又稱為IgY (Yolk Immunoglobulin)是存在于免疫后母雞卵黃中的一種7S免疫球蛋白，它具有產率高、穩定性好、特異性強等優點，是一種易于生產、廉價的抗體，免疫I只雞所收集到的僅I個雞蛋中含有的特異性IgY的量(約200mg)遠遠高于免疫I只兔所收集到的全部血清中的抗體量，IgY具有較強的耐酸、耐堿、耐熱能力。但是，目前國內外還沒有關于基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法的相關研究報道。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種穩定性、特異性和靈敏度高、免疫干擾小、背景低的基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法。本專利技術解決上述技術問題所采用的技術方案為一種基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法，包括以下步驟 (I)抗原預包被 將甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原用.01 M的pH為9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋至O. Ing/ul,按IOOul/孔加于聚苯乙烯96孔反應板中，4 °0放置過夜,次日傾去孔內液體,將孔用PBS-T洗滌液洗滌3次后，每孔加入I %牛血清白蛋白(BSA)封閉液，37 °C低速振蕩溫育I h進行封閉,封閉結束后,吸走孔內牛血清白蛋白封閉液；(2)檢測反應 將孔用PBS-T洗滌液清洗后，加入倍比稀釋的甲魚系統性敗血癥球狀病毒卵黃抗體IOOul，每梯度設I平行，同時設立空白對照和陰性對照，加蓋37 °C溫育I h后，用PBS-T洗滌液洗3次，再在每孔中加入IOOul的預先用1%牛血清白蛋白封閉液按I :10000比例稀釋的辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗雞IgG，37 °C溫育I h后，PBS-T洗滌液清洗5次，蒸餾水洗3次后，每孔加入新配置好的鄰苯二胺底物溶液IOOul，37 1暗處顯色15 min,每孔加50ul的2M H2SO4終止反應； (3)結果判定 在酶標儀上讀取各孔492 nm波長處的吸光度值，測定孔吸光度值大于陰性對照孔均值 2. I倍以上者判為陽性。步驟(I)中所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原的制備過程如下選取患病甲魚，取甲魚內臟置于預先冰浴過的TNE緩沖液中，勻漿直至完全碎裂，將勻漿液在4°C，6000g條件下離心IOmin后，取上清液在4°C，8000g條件下離心20min，取再次離心所得上清液于4°C，35000g離心I. 5h后獲取一次沉淀物，將一次沉淀物的沉淀上層疏松部分用TM緩沖液小心沖洗掉，沉淀下層白色部分重懸于Iml的TM緩沖液中，4°C冰浴過夜；次日將過夜處理的沉淀重新懸浮起來，4°C下3500g條件下離心5min后,取上清液于4°C, 38000g條件下離心I. 5h獲取二次沉淀物，將二次沉淀物的沉淀上層疏松部分小心去掉后，下層白色沉淀用少量TM緩沖液重懸后制成病毒懸浮液，即為甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原。步驟(2)中所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒卵黃抗體的制備過程如下 a.蛋雞免疫并收集免疫雞蛋 將蛋雞進行I次基礎免疫和2 3次加強免疫，所述的基礎免疫為在所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化后對蛋雞進行注射免疫，所述的加強免疫為在所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐劑，充分乳化后對蛋雞進行注射免疫，注射用量為每千克母雞注射500mg甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原，每次免疫間隔時間為15天，完成免疫后10天，開始收集雞蛋，于4°C冰箱保存； b.特異卵黃抗體的提取將上述得到的免疫雞蛋用酒精擦拭蛋殼并分離卵黃，吸取卵黃液，然后在卵黃液中加入卵黃液10倍體積的O. 05 M的pH為5. O的乙酸-乙酸鈉緩沖液，混勻后于4 °C冰箱靜置過夜處理，將過夜處理后的混合液于4 0C，IOOOOg的條件下離心20 min后取上清液，在上清液中加入飽和的(NH4)2SO4使其終濃度為40%，4 °C靜置10h，再IOOOOg離心20 min后取沉淀，將沉淀用140g/L的Na2SO4稀釋至100 ml，再次于4°C靜置10 h后，10000 g離心20 min，沉淀用O. OlM的pH為7. 2的PBS重懸，最后用截留量為100KD的透析袋透析除鹽得到甲魚系統性敗血癥球狀病毒卵黃抗體。所述的TNE緩沖液的pH為 . 5，配制終濃度如下50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl,5mM乙二胺四乙酸分(EDTA)，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)。所述的TM緩沖液的pH為 . 5，配制終濃度如下50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2，ImM PMSF。 所述的PBS-T洗滌液為吐溫-20與PBS緩沖液按體積比1:2000的比例混合得到，所述的PBS緩沖液濃度為O. I M，pH為7. 4。所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒卵黃抗體的稀釋倍比為I :640，1 =1280,1 2560，I5120,I:10240。所述的鄰苯二胺底物溶液的配制濃度為每100 ml鄰苯二胺底物溶液含檸檬酸O.73 g，Na2HPO4 · 2H20 I. 186 g，鄰苯二胺 O. 04 g，30% H2O2 150 ul。與現有技術相比，本專利技術的優點在于本專利技術首次公開了基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法，本專利技術以純化的TSSSV為抗原免疫蛋雞獲得了特異性的抗TSSSV-IgY，制備的特異性抗TSSSV-IgY可用于TSSSV間接ELISA檢測，與兔源、鼠源的抗體相比，IgY具有物理性質穩定，制備簡單，產量高，成本低，可明顯降低假陽性出現率等優點，利用TSSSV-IgY進行ELISA檢測診斷具有穩定性、特異性和靈敏度高、免疫干擾小、背景低等優點，同時TSSSV-IgY制備簡單，不需要取血等操作對動物造成傷害，母雞在經20-30mg高度保守的抗原進行免疫后可引起高效價的IgY長時間的分泌，這為用Ig本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法，其特征在于包括以下步驟：（1）抗原預包被將甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原用.01？M？的pH？為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至0.1？ng/ul，按100ul/孔加于聚苯乙烯96孔反應板中，4℃放置過夜，次日傾去孔內液體，將孔用PBS？T洗滌液洗滌3次后，每孔加入1？%？牛血清白蛋白封閉液，37？℃低速振蕩溫育1？h進行封閉，封閉結束后，吸走孔內牛血清白蛋白封閉液；（2）檢測反應將孔用PBS？T洗滌液清洗后，加入倍比稀釋的甲魚系統性敗血癥球狀病毒卵黃抗體100ul，每梯度設1平行，同時設立空白對照和陰性對照，加蓋37？℃溫育1？h后，用PBS？T洗滌液洗3次，再在每孔中加入100ul的預先用1%牛血清白蛋白封閉液按1：10000比例稀釋的辣根過氧化酶標記的羊抗雞IgG，37？℃溫育1？h后，PBS？T洗滌液清洗5次，蒸餾水洗3次后，每孔加入新配置好的鄰苯二胺底物溶液100ul，37？℃暗處顯色15？min，每孔加50ul的2M？H2SO4終止反應；（3）結果判定在酶標儀上讀取各孔492？nm波長處的吸光度值，測定孔吸光度值大于陰性對照孔均值2.1倍以上者判為陽性。...

【技術特征摘要】
1.一種基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法，其特征在于包括以下步驟 (1)抗原預包被 將甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原用.01 M的pH為9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋至O. Ing/ul，按IOOul/孔加于聚苯乙烯96孔反應板中，4°C放置過夜，次日傾去孔內液體，將孔用PBS-T洗滌液洗滌3次后，每孔加入I %牛血清白蛋白封閉液，37 °C低速振蕩溫育I h進行封閉，封閉結束后,吸走孔內牛血清白蛋白封閉液； (2)檢測反應 將孔用PBS-T洗滌液清洗后，加入倍比稀釋的甲魚系統性敗血癥球狀病毒卵黃抗體IOOul，每梯度設I平行，同時設立空白對照和陰性對照，加蓋37 °C溫育I h后，用PBS-T洗滌液洗3次，再在每孔中加入IOOul的預先用1%牛血清白蛋白封閉液按I :10000比例稀釋的辣根過氧化酶標記的羊抗雞IgG，37 °C溫育I h后，PBS-T洗滌液清洗5次，蒸餾水洗3次后，每孔加入新配置好的鄰苯二胺底物溶液IOOul，37 1暗處顯色15 min，每孔加50ul的2M H2SO4終止反應； (3)結果判定 在酶標儀上讀取各孔492 nm波長處的吸光度值，測定孔吸光度值大于陰性對照孔均值2. I倍以上者判為陽性。2.根據權利要求I所述的基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法，其特征在于步驟(I)中所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原的制備過程如下選取患病甲魚，取甲魚內臟置于預先冰浴過的TNE緩沖液中，勻漿直至完全碎裂，將勻漿液在40C，6000g條件下離心IOmin后，取上清液在4°C，8000g條件下離心20min，取再次離心所得上清液于4°C，35000g離心I. 5h后獲取一次沉淀物，將一次沉淀物的沉淀上層疏松部分用TM緩沖液小心沖洗掉，沉淀下層白色部分重懸于Iml的TM緩沖液中，4°C冰浴過夜；次日將過夜處理的沉淀重新懸浮起來，4°C下3500g條件下離心5min后,取上清液于4°C, 38000g條件下離心I. 5h獲取二次沉淀物，將二次沉淀物的沉淀上層疏松部分小心去掉后，下層白色沉淀用少量TM緩沖液重懸后制成病毒懸浮液，即為甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原。3.根據權利要求2所述的基于卵黃抗體的甲魚系統性敗血癥球狀病毒間接ELISA檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒卵黃抗體的制備過程如下 a.蛋雞免疫并收集免疫雞蛋 將蛋雞進行I次基礎免疫和2 3次加強免疫，所述的基礎免疫為在所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化后對蛋雞進行注射免疫，所述的加強免疫為在所述的甲魚系統性敗血癥球狀...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李登峰，彭嬌，周永強，劉聯國，陳炯，顧曉英，
申請(專利權)人：寧波大學，
類型：發明
國別省市：