本發(fā)明專利技術屬于農(nóng)學門類，植物保護學科，具體涉及柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙。該檢測試紙制備如下：通過從帶有柑橘黃龍病亞洲種病原抗原的長春花寄主提取和純化病原菌抗原，用于注射免疫兔子獲得黃龍病亞洲種病原特異抗血清，純化得到柑橘黃龍病亞洲種病原抗體，制備免疫膠體金，進而制備浸泡有免疫膠體金的結合墊、噴有檢測線T-柑橘黃龍病亞洲種病原抗體和質(zhì)量控制線C-羊抗兔抗體的層析膜，然后組裝檢測試紙產(chǎn)品。本發(fā)明專利技術針對柑橘黃龍病大量樣品檢測的需求，提供一種方便快捷、特異性高的柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙，具有以下優(yōu)點：1.方便使用，操作簡單；2.短時間獲得檢測結果；3.穩(wěn)定性好；4.成本低，特別適用于果園柑橘黃龍病病株鑒定。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于農(nóng)學門類，植物保護學科，具體涉及柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙。
技術介紹
柑橘黃龍病是世界柑橘生產(chǎn)上ー種毀滅性病害，被各個國家列入檢疫性病害。引起該病害的病原是ー種稱為韌皮部桿菌的限韌皮部生長的內(nèi)生細菌(CadidatusLiberibacter sp.)。目前已經(jīng)知道柑橘黃龍病有亞洲種LiberibacterassiaたfCtts)、非洲種{Candidatus Liberibacter africanus)和美洲種 CLiberibacter affieri/ws)三個種。在中國發(fā)生的黃龍病是由亞洲種病原引起的。柑橘黃龍病可以通過接穗、苗木和介體木風(亞洲木風，Diaphorina citri,非洲木風，Trioza erytreae)傳播。黃龍病病原菌在自然界的寄主植物種類較多，能侵染各類柑橘品種包括寬皮橘類、橙類、柚類、檸檬類等品種，目前未發(fā)現(xiàn)免疫品種。柑橘木虱的其它 寄主還包括九里香(Murraya paniculata)、黃皮(Clansena Iansium)等13種蕓香科植物。由于至今還沒有根治柑橘黃龍病的技術方法，綜合防控是目前防止黃龍病蔓延的主要和比較有效的方法。即消除病源，及時鏟除果園黃龍病病株和撲殺木虱。準確診斷、及時銷毀黃龍病病株，是綜合防控成功的關鍵技術之ー(劉利華等，2010;Bov6，2006)。目前柑橘黃龍病病原菌的檢測方法主要有病葉組織超薄切片電鏡下檢查病原菌的方法、單克隆和多克隆抗體的免疫學方法(如ELISA)，以及PCR等分子生物學檢測方法等(Garnier M.，1991 ；Gao S，et al.，1993 ;李德望，1992 ;田亞南等，1998)。超薄切片技術和電鏡黃龍病病原菌檢查的方法雖然可靠，但是該方法樣品制備過程復雜，需要一般實驗室不具有的超薄切片機、透射電子顯微鏡等精密儀器，而且病原檢出率不高。單克隆和多克隆抗體等免疫學檢測方法，根據(jù)已報道的研究結果，這些方法存在不同寄主和不同地域病原的專化性等問題。PCR方法是目前實驗室廣泛用于檢測黃龍病病原的技術，但是檢測樣品量也十分有限，一般每人每天能夠檢測10個樣品，檢測結果最快需要2天才能夠獲得。檢測黃龍病病原菌的電鏡方法、免疫學方法和PCR方法，都需要專業(yè)人員在實驗室借助儀器設備才能夠完成。除上所述黃龍病病原菌檢測方法外，還有根據(jù)柑橘病樹癥狀進行黃龍病診斷的方法、包括田間癥狀診斷和指示植物診斷方法等。果園管理不良、營養(yǎng)缺乏(如缺乏鎂、鋅等元素)，或其它病蟲害的侵入，如柑橘碎葉病、衰退病、蟲害(如星天牛)、線蟲等因素也會引起柑橘植株葉片表現(xiàn)黃化癥狀，或者因為黃龍病病原與其他病原的混合侵入等導致葉片黃化。因此田間癥狀診斷方法不但需要有黃龍病經(jīng)驗豐富的專業(yè)人員，也容易出現(xiàn)錯誤診斷。指示植物診斷方法周期太長，是早期黃龍病病害診斷的方法，現(xiàn)在已經(jīng)不用于黃龍病的診斷。綜上所述，目前的柑橘黃龍病病原檢測，包括免疫學、電鏡和分子生物學等方法都需要專業(yè)人員在實驗室利用驗儀器設備才能夠完成。這些方法難以滿足柑橘果園黃龍病監(jiān)測的需要。本專利技術就是針對柑橘黃龍病大量樣品檢測的需求，提供ー種方便快捷、特異性高的檢測產(chǎn)品。
技術實現(xiàn)思路
針對上述問題，本專利技術提供了柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙。本專利技術目的通過以下措施來實現(xiàn) 一、柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙的制備通過從帶有柑橘黃龍病亞洲種病原抗原的長春花寄主提取和純化病原菌抗原，用于注射免疫兔子獲得黃龍病亞洲種病原特異抗血清，純化得到柑橘黃龍病亞洲種病原抗體，制備免疫膠體金，進而制備浸泡有免疫膠體金的結合墊、噴有檢測線T-柑橘黃龍病亞洲種病原抗體和質(zhì)量控制線C-羊抗兔抗體的層析膜，然后組裝檢測試紙產(chǎn)品。 如圖I所示(檢測試紙結構示意圖)，在PVC膠版上依次黏貼層析膜、膠體金結合墊、樣品墊、吸水材料，從而組裝成柑橘黃龍病病原亞洲種病原檢測試紙條。層析膜如硝酸纖維素NC180膜，膠體金結合墊如聚酯纖維膜KL20，樣品墊如SB08。ニ、柑橘黃龍病亞洲種病原的檢測與黃龍病的診斷，通過采集疑似柑橘黃龍病病株的病葉，加水研磨后，將檢測試紙條的樣品端插入研磨液，顯示出2條紅色條帶的為黃龍病病株。檢測方法具體操作如下 (I)柑橘黃龍病檢測樣品的制備 自疑似柑橘黃龍病病株取有斑駁黃化癥狀的葉片，用剪刀剪取病葉主脈、剪碎，按照葉脈與水大約I : 10的重量比研磨，至研磨液粘稠，室溫下靜置20分鐘左右。(2)柑橘黃龍病檢測試紙的使用 取柑橘黃龍病病原檢測試紙，將其樣品墊一端插入待測樣品溶液中0. 5cm，樣品液泳動到吸水紙端20分鐘后取出試紙，然后平放在干凈和干燥的水平物體的表面，靜置2個小吋。(3)柑橘黃龍病病株的確定 帶有柑橘黃龍病亞洲種病原的樣品，檢測試紙條在檢測線和質(zhì)控線位置都出現(xiàn)紅色條帶(共2條紅色條帶),確認為柑橘黃龍病病株，僅質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅色條帶的樣品則不能確認為黃龍病病株。本專利技術的優(yōu)點 柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙具有以下優(yōu)點I.方便使用，操作簡單，不需經(jīng)過特殊培訓；2.短時間獲得檢測結果，得出結論；3.穩(wěn)定性好，不需冷蔵；4.生產(chǎn)成本和檢測成本均較低；5.本專利技術的柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙條是建立在層析法免疫膠體金基礎上的一種檢測黃龍病病原的方法，具有新穎性和實用性，特別適用于果園柑橘黃龍病病株鑒定。附圖說明圖I為檢測試紙結構示意圖；其中I-膠體金結合墊，2-檢測線T，3_質(zhì)控線C，4-吸水材料，5-樣品墊，6-層析膜(NC硝酸纖維素膜)，7-PVC膠板。圖2為實施例I樣品檢測結果。圖3為實施例2樣品檢測結果。 圖4為實施例3樣品檢測結果。具體實施例方式本專利技術的柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙具體制備如下 (I)柑橘黃龍病亞洲種病原菌抗原制備(參照Gao S，1993)取30g表現(xiàn)黃龍病癥狀的長春花病葉(病原為采自廣東柑橘果園的黃龍病病枝，經(jīng)菟絲子轉接到長春花，然后通過病枝嫁接到健康長春花苗保存)，加1200mL磷酸鹽緩沖液(PBS500, PBS含500mM NaCl)，研磨成勻漿，四層紗布過濾，濾液l，200g離心10分鐘后，取上清液100°C加熱5分鐘，15, OOOg離心20分鐘，上清液加入65%硫酸銨(按照約20%體積比例)，4°C沉淀30分鐘，15, OOOg離心30分鐘，沉淀用PBS500懸浮，懸浮液用10%三氯こ酸(TCA)處理20分鐘，15, OOOg離心30分鐘，沉淀重新懸浮于PBS500，PH值調(diào)節(jié)至7. 4， 取I體積的氯仿加到懸浮小球液中，震蕩，2，000g離心10分鐘分相，收集水相，在透析袋中于10%PEG6000中4°C濃縮I小時，15,OOOg離心30分鐘，小球重新懸浮于TD緩沖液(Tris-HCl, pH7. 4,5mM EDTA，0. 0176% 抗壞血酸-維生素C，IOOmM PMSF-苯甲基磺酰氟)，制備液用0. 5%TritonX_100和0. 5%脫氧膽酸鈉室溫下孵育I小吋，18, OOOg離心I小時，沉淀用PBS500懸浮，28，OOOg離心15分鐘(重復該步驟一次)，沉淀用0. 8ml的0. 3M甘氨酸0. 5M甘露醇懸浮,4，OOOrpm離心20min，上清液用于免疫。(2)抗血清的制備 實驗動物本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種柑橘黃龍病亞洲種病原檢測試紙，其特征在于：通過從帶有柑橘黃龍病亞洲種病原抗原的長春花寄主提取和純化病原菌抗原，用于注射免疫兔子獲得黃龍病亞洲種病原特異抗血清，純化得到柑橘黃龍病亞洲種病原抗體，制備免疫膠體金，進而制備浸泡有免疫膠體金的結合墊、噴有檢測線T？柑橘黃龍病亞洲種病原抗體和質(zhì)量控制線C？羊抗兔抗體的層析膜，然后組裝檢測試紙產(chǎn)品。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：劉利華，朱祥枝，陳軍，甘云，陳玉妹，
申請(專利權)人：福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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