本發明專利技術公開了一種酶活性及熱穩定性提高的脂肪氧合酶，是在GenBank?PA119公布的基因序列編碼的蛋白質基礎上，其N端氨基酸缺失，其中缺失尤以缺失30個為佳。使用本方法得到的新型脂肪氧合酶，酶學性質較好的突變株，熱穩定性提高2.1倍，比酶活仍能維持初始的90%。改造后的酶更適合工業應用，可降低生產成本，提高生產效率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種脂肪氧合酶，特別是一種酶活性及熱穩定性提高的脂肪氧合酶。技術背景微生物脂肪氧合酶(Lipoxygenase, LOX, ECl, 13. 11. 12)屬于氧化還原酶,是一類含非血紅素鐵的蛋白質，能專一催化具有順，順4-烯結構的多不飽和脂肪酸，通過分子內加氧，形成具有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物，此物質是相當重要的化學和藥物合成的中間體，同時能將其轉化為酮，是食品風味物質醛與醇的前體物質。因此在食品領域有著廣泛的應用前景。但脂肪氧合酶自身的一些缺陷如比酶活、熱穩定性等因素，限制了脂肪氧合酶的應用范圍。因此基于已得到的脂肪氧合酶在大腸桿菌中的表達平臺，利用氨基酸缺失，對脂肪氧合酶進行分子改造，以期得到酶學性質更適合工業應用的脂肪氧合酶。
技術實現思路
為改善脂肪氧合酶比酶活低，熱穩定性差的現狀，本研究通過對脂肪氧合酶的N 端氨基酸進行缺失，從而使其柔性降低剛性增強，改變催化特性，提高熱穩定性。為解決上述技術問題，本專利技術的技術方案為在GenBank PA1169公布的基因序列編碼的氨基酸基礎上，其N端氨基酸缺失，其中N端氨基酸缺失優選20個和30個氨基酸， 更優選30個。產所述脂肪氧合酶的基因工程菌或轉基因細胞系也為本專利技術要求保護的范圍。本專利技術要解決的另一個技術問題是提供一種構建所述產脂肪氧合酶基因工程菌的構建方法 ，其特征在于包括如下步驟I)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼權利要求1所述編碼脂肪氧合酶的基因；2)將步驟I)獲得的基因連接到大腸桿菌表達載體，得到重組表達載體；3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉化E. coli Rosetta(DE3)得到基因工程菌。所述表達載體為pET_22b (+)。應用所述基因工程菌發酵生產角蛋白酶的方法為以脂肪氧合酶基因工程菌為生產菌株，37°C，培養12h，轉接到TB培養基中，接種量為1%。菌體長到0D600為O. 6時，加入 IPTG誘導，并將培養溫度降到20°C，培養50h。本專利技術所用到的培養基LB 培養基胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L，pH7. O ；TB 培養基蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，甘油 8g/L，17mmol/LKH2P04, 72mmol/ LK2HPO4。本專利技術中脂肪氧合酶活力的測定采用分光光度法測定LOX酶活。I個單位LOX酶活定義為25°C下每分鐘催化底物形成Iymol亞油酸氫過氧化物(HPOD)的酶量(U/mL)。酶活測定條件以亞油酸為底物， 在25°C條件下利用Shimadzu UV-2450分光光度計在線測定234nm下吸光值的變化，以吸光值變化曲線初始部分的斜率計算酶活。底物0.3mM 亞油酸溶于 O. 15M K2HPO4-KH2PO4 緩沖液(pH7. 5)。本專利技術中脂肪氧合酶熱穩定的測定重組酶熱穩定性用酶在50° C下酶活性的半衰期(min)來表示。將純化后的酶用 buffer A稀釋到蛋白濃度為100 μ g/mL并在50° C保溫，間隔測定殘余酶活，將殘余酶活擬合并計算半衰期。本專利技術以脂肪氧合酶在大腸桿菌中的高效表達為改造平臺，對脂肪氧合酶成熟酶 N端氨基酸進行缺失，得到了酶學性質較好的突變株，熱穩定性提高2.1倍，比酶活仍能維持初始的90%。改造后的酶更適合工業應用，可降低生產成本，提高生產效率。具體實施方式實施例1熱穩定性提高的脂肪氧合酶在GenBank PAl 169公布的基因序列編碼的氨基酸基礎上，其N端氨基酸缺失，其中N端氨基酸缺失優選20個和30個氨基酸，更優選30個，所述N端缺失的脂肪氧合酶可以通過化學全合成或PCR方法獲得。實施例2產高活性及熱穩定脂肪氧合酶基因工程菌的獲得(I)利用定點突變試劑盒(TaKaRa)，設計3對引物(如表I示)，以先前以構建的 pET-22b (+) /pre- L0X(Lu X，Zhang J, Liu S, Zhang D, Xu Z, Wu J, Li J, Du G，Chen J (2012) Overproduction, purification, and characterization of extracellular lipoxygenase ofPseudomonas aeruginosa in Escherichia col1. Appl Microbiol Biot:Diol0. 1007/ S00253-012-4457-6)為模版，進行PCR或通過化學全合成的方法，分別缺失脂肪氧合酶N端的10、20、30、40個氨基酸，缺失10個氨基酸命名為D10，以此類推，缺失40個氨基酸命名為 D40，轉化子由上海生工進行測序。(2)將測序正確的質粒，轉化E. coli Rosetta (DE3)，獲得產脂肪氧合酶基因工程菌。表InamesequencesenseGGGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCATAATGACTCGATATTCTTTTCN10-scnsc GGGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCATTACCTCGGGGCGGAACAAN20-sense GGGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCATGATGCCTCGCGAAGTTTGN30-scnsc GGGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCAXWTCCGCCGAGTTTGCCGCN40-sense GGG.4ATTCCATATGCATCATCATCATCATCATCTGGCCGGAAAGTTGGCamiscnseCCCAAGCTTTCAGATATTGGTGCTCGCCGGGATAC實施例3高活性及熱穩定脂肪氧合酶的驗證(I)接種實施例2中的基因工程菌到LB液體培養基中，37°C，培養12h，轉接到TB培養基中，接種量為1%。菌體長到0D600為0. 6時，加入IPTG誘導，并將培養溫度降到20°C， 培養50h。 (2)收集發酵上清，檢測發酵上清酶活，并對樣品進行His-鎳柱純化，純化蛋白。(3)對純化的蛋白的熱穩定性和最適溫度進行測定，結果如表2所示。實驗結果表明與野生型相比較，DlO比酶活與熱穩定性變化不大，但D20與D30在50°C時半衰期分別增加了 1.3、2.1倍。同時，D20與D30的最適反應溫度也相應的提高了 5°C，10°C。表明N端部分缺失有利于提聞酶的熱穩定性。(4)對純化的蛋白的Km值和比酶活進行測定，結果如表2所示。實驗結果表明與野生型相比較，D20與D30的Km值有較小的增加，表明缺失N端會影響酶的底物親和力，但其比酶活的損失卻不超過10%。表權利要求1.一種酶活性及熱穩定性提高的脂肪氧合酶，其特征在于在GenBank PA1169公布的基因序列編碼的脂肪氧合酶基礎上，其N端氨基酸缺失。2.權利要求1所述的脂肪氧合酶，其特征在于所述N端氨基酸缺失20個。3.權利要求1所述的脂肪氧合酶，其特征在于所述N端氨基酸缺失30個。4.一種獲得權利要求1所述脂肪氧合酶的方法，其特征在于以GenBank PA119公布的基因為出發基因，將其編碼脂肪氧合酶N端的序列進行缺失。5.產權利要求1所述脂肪氧合酶的基因工程菌或轉基因細胞系。6.權利要求5所本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種酶活性及熱穩定性提高的脂肪氧合酶，其特征在于在GenBank?PA1169公布的基因序列編碼的脂肪氧合酶基礎上，其N端氨基酸缺失。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳堅，堵國成，劉松，陸信曜，馮岳，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。