一種增強(qiáng)嫁接植物病毒抗性的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種增強(qiáng)嫁接植物病毒抗性的方法，該方法包括：（1）番茄播種，播種前經(jīng)無菌水浸潤5~8小時(shí)后于培養(yǎng)箱中催芽；（2）切子葉預(yù)培養(yǎng)；（3）將根癌農(nóng)桿菌侵染預(yù)培養(yǎng)過的葉盤外植體，進(jìn)行共培養(yǎng)；（4）將根癌農(nóng)桿菌侵染后的子葉轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基C中分化出芽；（5）促分化培養(yǎng)；（6）生根培養(yǎng)；（7）田間培養(yǎng)。本發(fā)明專利技術(shù)方法可縮短出芽1周左右，且出芽整齊，分化效率高，可有效防止假陽性，能有效促進(jìn)正常芽的分化與生長。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用，特別是一種使番茄接穗品種獲得病毒抗性的方法及RNA干擾載體與轉(zhuǎn)基因方法。
技術(shù)介紹
植物病毒是導(dǎo)致果樹、蔬菜、花卉等園藝植物產(chǎn)量下降和品質(zhì)變劣的重要原因， 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病毒病是僅次于真菌的第二大類病害，由于防治困難，素有“植物癌癥” 之稱。目前植物病毒常用的防治措施有消滅病毒源和傳統(tǒng)媒介、應(yīng)用脫毒技術(shù)、藥劑防治與選育抗病品種等，其中選育抗病品種是防治病毒病害最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法。RNA干擾技術(shù)為基礎(chǔ)的植物抗病技術(shù)因其高效性、特異性等特點(diǎn)，在植物抗病毒育種上展現(xiàn)了可觀的前旦-5^ O基因沉默或稱RNA干擾(RNA interference ；RNAi)是指由于轉(zhuǎn)基因序列或外侵病毒與被沉默的內(nèi)源或外源基因序列具有高度的同源性，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)結(jié)構(gòu)，從而特異性地降解同源祀基因mRNA,使之發(fā)生沉默(Fire A. , Xu S. , Montgomery Μ. Κ. , et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans . Nature, 1998，391(6669) :806-811)。由于其干擾作用是發(fā)生在靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平，因此，也成轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing ;PTGS)。植物RNAi 具有特異性、高效性、系統(tǒng)性以及可遺傳性等特點(diǎn)。可利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因功能研究；或直接利用RNAi 創(chuàng)造的特殊性狀變異體進(jìn)行植物改良。其中RNAi技術(shù)在植物病毒抗性方面取得了很好的研究成果。RNAi是真核生物中普遍存在的外源核酸( 如病毒)入侵的防御機(jī)制，同時(shí)現(xiàn)有研究進(jìn)一步表明病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)是由于誘導(dǎo)病毒(弱株系)所產(chǎn)生的RNA沉默降解了具有致病性的同源病毒(強(qiáng)株系)的結(jié)果(Frank G. R. , Stuart A. M. and David C. B. Gene Silencing without DNA: RNA-Mediated Cross-Protection between Viruses. Plant Cell, 1999，11: 1207-1216)。利用RNAi抵抗病毒的常用策略是選擇一段植物病毒基因的序列，以反向重復(fù)序列的方式構(gòu)建成轉(zhuǎn)錄后含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA(hairpin RNA,hpRNA) 或含內(nèi)含子的ihpRNA (intron-hairpin RNA)表達(dá)載體,通過基因槍、病毒載體轉(zhuǎn)染或者農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化整合到植物基因上，體內(nèi)表達(dá)dsRNA，直接或間接誘導(dǎo)RNAi的產(chǎn)生，起到抵抗病毒的目的。而在發(fā)夾結(jié)構(gòu)研究中，認(rèn)為ihpRNA表達(dá)載體比hpRNA表達(dá)載體沉默效率高(Helliwell C， Waterhouse P. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants . Methods, 2003, 30 (4) :289-295)。園藝植物種類與品種繁多，通過營養(yǎng)繁殖途徑繁衍的園藝植物后代普遍經(jīng)受著病毒的威脅。目前生產(chǎn)中栽培的眾多蔬菜，水果和花卉均有幾十到上百個(gè)品種，幾乎每個(gè)品種都有數(shù)種到數(shù)十種病毒病害，病毒病抑制了植物的生長、結(jié)果，降低了果品的產(chǎn)量、質(zhì)量，甚至引起死樹，植物一旦被病毒侵染，將終生帶毒持久受害。利用基因工程技術(shù)針對(duì)每一個(gè)品種進(jìn)行改良，提高其抗病毒的能力，雖可行但需花費(fèi)大量的人力與財(cái)力。嫁接是許多園藝植物繁殖的方法之一，絕大多數(shù)的果樹和部分蔬菜采用嫁接繁殖。嫁接既能保持接穗品種的優(yōu)良性狀，又能利用砧木的有利特性。在應(yīng)用嫁接繁殖時(shí)，一般同一種類中的不同品種采用同一砧木，甚至有些同屬中的不同種類也采用同一砧木。這樣一砧多用的情況，使得改良砧木品種比單獨(dú)改良接穗品種要高效的多。所謂植物系統(tǒng)性基因沉默是指dsRNA、aberrant RNA或siRNA等基因沉默信號(hào)既可以通過胞間連絲進(jìn)行的短距離傳遞，也可以通過植物中的維管系統(tǒng)長距離傳遞(BiOsnan C. A. , Mitter N. , Christie M. , et al. Nuclear gene silencing directs reception of long-distance mRNA silencing in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2007，104(37):14741-14746)，(Kalantidis K. , Schumacher H. T. , Alexiadis T., et al. RNA silencing movement in plants. Biol Cell, 2008, 100 (I):13-26), 并誘導(dǎo)整個(gè)植物產(chǎn)生系統(tǒng)沉默。Daniel H.等(Daniel H. C，F(xiàn)abio T. S. , Miya D. Η, et al. Pattern formation via small RNA mobility . Genes & Dev, 2009, 23: 549-554)研究表明小分子RNA可以作為一種移動(dòng)的信號(hào)分子參與植物發(fā)育的調(diào)控。關(guān)于沉默信號(hào)在植物中的傳遞方向存在著不同的報(bào)道。Palauqui等(Palauqui J. C.，Elmayan T. , Pollien J.M. , et al. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions , EMBO J, 1997，16 (15) :4738-4745.)以煙草為試材，發(fā)現(xiàn) PTGS的傳導(dǎo)是單方向的，即只能從沉默的站木傳向非沉默的接穗；而Sonoda等(Sonoda S. and Nishiguchi M. Graft transmission of post-transcriptional gene silencing: target specificity for RNA degradation is transmissible between silenced and non-silenced plants, but not between silenced plants . Plant J, 2000, 21(1) :1-8)研究表明，PTGS的傳導(dǎo)是雙方向的，從砧木到接穗或從接穗到砧木都可傳導(dǎo)， 但是PTGS從接穗到砧木的傳導(dǎo)效率明顯低于從砧木到接穗的傳導(dǎo)。李明等(李 明，姜世玲，王幼群，等.轉(zhuǎn)錄后沉默信號(hào)可以在擬南芥嫁接體內(nèi)快速雙向傳遞.科學(xué)通報(bào)，2006，51 (2) : 142-147)的結(jié)果表明，無論用RNAi型植株作為砧木或接穗，基因沉默信號(hào)均能導(dǎo)致相應(yīng)野生型接穗或砧木中靶基本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種制備轉(zhuǎn)基因番茄砧木的方法，包括如下步驟：（1）番茄播種，番茄的種子播種前經(jīng)無菌水浸潤5~8小時(shí)后于培養(yǎng)箱中催芽；（2）切子葉預(yù)培養(yǎng)，在真葉未出現(xiàn)前，子葉剛冒出種皮且未完全展開時(shí)，將子葉兩端切除1?2mm，再從中間橫切一刀，每個(gè)子葉切成兩塊，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；（3）將根癌農(nóng)桿菌侵染預(yù)培養(yǎng)過的葉盤外植體，進(jìn)行共培養(yǎng)；其中根癌農(nóng)桿菌含有對(duì)卡那霉素抗性基因標(biāo)記的載體；（4）將根癌農(nóng)桿菌侵染后的子葉轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基C中，葉背朝上光照培養(yǎng)，待愈傷上芽點(diǎn)出現(xiàn)，將帶芽點(diǎn)外植體轉(zhuǎn)入C1培養(yǎng)10~14d，分化出芽；其中，培養(yǎng)基C中：pH?6.0，Medium?Base?+2mg/L反式玉米素核苷+?200mg/L特美汀?+100mg/L卡那霉素；培養(yǎng)基C1中：pH?6.0，Medium?Base?+1?mg/L反式玉米素核苷?+80?mg/L卡那霉素?+200?mg/L特美汀；（5）促分化培養(yǎng)，待再生芽長出后切去白化外植體部分將抗性芽轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基C3中：pH?6.0，Medium?Base?+0.5?mg/L反式玉米素核苷?+1.5?mg/L?3?吲哚乙酸+80?mg/L卡那霉素+?200?mg/L特美汀；（6）生根培養(yǎng)，待抗性芽莖部長至1cm后，剔除愈傷組織，切下置入培養(yǎng)基D中生根培養(yǎng)15~30d，培養(yǎng)基D為：pH?6.0，Medium?Base?+2mg/L吲哚丁酸+?200mg/L特美汀；（7）田間培養(yǎng)：移栽至大田。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊國順，白描，鐘曉紅，熊興耀，鄧子牛，石雪暉，陳文婷，周敏，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：