本發明專利技術提供了一種以寬內徑持卵管去除哺乳動物卵母細胞核的方法，該方法采用寬內徑(內徑相當于卵母細胞直徑1/5～1/4)持卵管吸持卵母細胞，輔助孵化針在第一極體處切開透明帶，寬內徑持卵管水平對準透明帶裂隙加負壓吸出第一極體和1/10～1/8的胞漿，輔助孵化針撥動或轉動卵母細胞，使吸出的帶核胞漿部分與卵母細胞脫離。本發明專利技術中持卵管同時起到了持卵和吸去核的作用，操作簡便，減少了去核步驟，縮短了去核操作時間，提高了去核成功率，減少了卵母細胞的損害，有利于后續核移植過程中胚胎的發育。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程
的一種去除卵母細胞核的方法，特別涉及。
技術介紹
哺乳動物體細胞核移植技術是指將去除核的卵母細胞作為受體，以體細胞核作為供體，通過人工手段使兩者融合構建重構胚，如將該胚胎移植到代孕母體子宮內并產生個體，則稱之為克隆動物；如將重構胚用于胚胎干細胞建系，則稱之為體細胞核移植胚胎干細胞。通過體細胞核移植技術已相繼誕生了羊、牛、豬、鼠、兔等哺乳動物和各種核移植胚胎干細胞系。該技術為家畜繁殖、瀕危動物拯救、人類器官移植等細胞組織工程開辟了廣闊的應用前景。但是，目前體細胞核移植技術仍有一系列問題尚待解決，如重構胚發育阻滯、胚胎質量低下、流產、克隆動物異常、動物克隆效率低下等等，這些都制約了體細胞核移植技術的應用和發展。哺乳動物卵母細胞去核獲取核移植受體是體細胞核移植技術中的關鍵步驟，去核效率的高低和核移植受體的質量直接關系到所構建的重構胚體外發育和此后的胚胎種植率、妊娠率或胚胎干細胞建系的效率 。哺乳動物卵母細胞外面包繞著透明帶，卵母細胞胞核常靠近剛排除的第一極體附近。如要去除第一極體和卵母細胞核，則需要在透明帶上開一小口或小裂隙。常規的方法是分兩步進行，第一步是對透明帶進行處理，第二步再換上吸管，在持卵管固定卵母細胞的情況下進行去核及去極體操作。該類方法增加了鏡下操作步驟，延長了操作時間，獲取的核移植受體質量會受影響，同時吸管如進入透明帶內操作可過度損傷卵母細胞膜而難以恢復或卵母細胞破裂。也有方法是在對透明帶處理后不更換吸管的情況下對卵母細胞進行去核，如采用顯微切割針擠壓卵母細胞使得第一極體及核從透明帶開口處擠出。但擠壓的力度等顯微操作難以把握，去核效果常不理想，或需要一種特殊的持卵管，增加了實驗的難度。
技術實現思路
針對
技術介紹
中的問題，本專利技術提供一種操作簡便、卵母細胞損傷小、去核效率高的哺乳動物卵母細胞去核方法。，所述方法采用輔助孵化針在卵母細胞第一極體處透明帶切開一裂隙，再用持卵管負壓除去第一極體及其附近的胞核。作為本專利技術的優選技術方案，采用寬內徑的持卵管，其內徑為被去核卵母細胞直徑的1/4 1/5。作為本專利技術的優選技術方案，持卵管兼持卵和負壓去核的功能。作為本專利技術的優選技術方案，采用輔助孵化針轉動或撥動卵母細胞，使吸出的帶核胞漿部分與卵母細胞脫離，透明帶裂隙的張力修復卵母細胞損傷處。作為本專利技術的優選技術方案，所述卵母細胞來源于哺乳動物，包括人、小鼠、大鼠、兔、羊、狗、貓、牛等。本專利技術所帶來的有益效果是本專利技術中持卵管同時起到了持卵和吸去核的作用，操作簡便，減少了去核步驟，縮短了去核操作時間，提高了去核成功率，減少了卵母細胞的損害，提高核移植受體的質量，有利于后續核移植過程中胚胎的發育。附圖說明圖1是處于第二次減數分裂中期的哺乳動物卵母細胞基本結構示意圖。圖2是寬內徑持卵管前端結構示意圖。圖3是寬內徑持卵管吸持卵母細胞效果示意圖,第一極體處于6點鐘位置。 圖4是輔助孵化針從第5點鐘位置進入透明帶，從第7點鐘位置穿出透明帶，對卵母細胞透明帶進行切割示意圖。圖5是寬內徑持卵管水平對準第一極體和透明帶裂隙負壓吸出第一極體和卵母細胞核示意圖。圖6是在輔助孵化針的撥動或轉動下，是使吸出的帶核胞漿部分與卵母細胞脫離示意圖。圖中標號為1-透明帶2-卵母細胞 3-第一極體4-寬內徑持卵管 5-持卵管內徑 6-持卵管外徑7-輔助孵化針 8-帶核胞漿具體實施例方式下面結合附圖對本專利技術的較佳實施例進行詳細闡述，以使本專利技術的優點和特征能更易于被本領域技術人員理解，從而對本專利技術的保護范圍做出更為清楚明確的界定。參見圖2，在拉針儀和鍛針儀上制備寬內徑(內徑相當于卵母細胞直徑1/5 1/4)持卵管。調試好顯微操作系統。將待拆除顆粒細胞的待去核的人卵母細胞(MII)轉移HTF-HEPES微滴中，置于顯微操作系統倒置顯微鏡上。參見圖3，用寬內徑持卵管吸持卵母細胞，將極體置于6點鐘或12點鐘的位置。參見圖4，輔助孵化針在第一極體處切開透明帶，裂隙約為透明帶周長的1/4(如第一極體處于6點鐘的位置，則輔助孵化針從第5點鐘位置進針，從第7點鐘位置出針，避開卵母細胞膜，并在5點鐘和7點鐘之間切開透明帶)。參見圖5，將寬內徑持卵管水平對準透明帶裂隙加負壓吸出第一極體和1/10 1/8的胞漿。可采用氣壓，注意負壓不要太大，壓力變化要小，防止卵母細胞潰破。參見圖6，輔助孵化針撥動或轉動卵母細胞，使吸出的帶核胞漿部分與卵母細胞脫離(該過程類似從一大面團上捏下一小面團)，利用透明帶裂隙的張力自動修復卵母細胞膜。此后可采用Hochest33342檢測核的情況，如被去核的卵母細胞情況良好，則可應用于后續的核移植實驗。以上所述，僅為本專利技術的具體實施方式，但本專利技術的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本領域的技術人員在本專利技術所揭露的技術范圍內，可不經過創造性勞動想到的變化或替換，都應涵蓋在本專利技術的保護范圍之內。因此，本專利技術的保護范圍應該以權利要求書所限定的保護范圍為準。權利要求1.，其特征在于，所述方法采用輔助孵化針在卵母細胞第一極體處透明帶切開一裂隙，再用持卵管負壓除去第一極體及其附近的胞核。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，采用寬內徑的持卵管，其內徑為被去核卵母細胞直徑的1/4 1/5。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，持卵管兼持卵和負壓去核的功能。4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用輔助孵化針轉動或撥動卵母細胞，使吸出的帶核胞漿部分與卵母細胞脫離，透明帶裂隙的張力修復卵母細胞損傷處。5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述卵母細胞來源于哺乳動物，包括人、小鼠、大鼠、兔、羊、狗、貓、牛等。全文摘要本專利技術提供了，該方法采用寬內徑(內徑相當于卵母細胞直徑1/5～1/4)持卵管吸持卵母細胞，輔助孵化針在第一極體處切開透明帶，寬內徑持卵管水平對準透明帶裂隙加負壓吸出第一極體和1/10～1/8的胞漿，輔助孵化針撥動或轉動卵母細胞，使吸出的帶核胞漿部分與卵母細胞脫離。本專利技術中持卵管同時起到了持卵和吸去核的作用，操作簡便，減少了去核步驟，縮短了去核操作時間，提高了去核成功率，減少了卵母細胞的損害，有利于后續核移植過程中胚胎的發育。文檔編號C12N15/873GK102994553SQ20111026892公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月13日 優先權日2011年9月13日專利技術者諶兵來, 高擎, 曾橋 申請人:諶兵來, 高擎, 曾橋本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種以寬內徑持卵管去除哺乳動物卵母細胞核的方法，其特征在于，所述方法采用輔助孵化針在卵母細胞第一極體處透明帶切開一裂隙，再用持卵管負壓除去第一極體及其附近的胞核。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：諶兵來，高擎，曾橋，
申請(專利權)人：諶兵來，高擎，曾橋，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。