一種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法技術

本發明專利技術涉及一種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法，其具體步驟為：將準備拔取毛發的部位貼根部剪去至僅留0.2-0.3cm左右毛發根，75％酒精消毒10min；漂洗；將單根毛發種入培養皿中，采用毛囊干細胞培養基培養；1周后每3-4天換液一次；E、逆轉錄病毒包裝；誘導毛囊干細胞重編程為iPS細胞；毛囊干細胞來源的iPS細胞維持培養及鑒定。本發明專利技術過程簡單；無需蛋白酶消化成單細胞；擴增的毛囊干細胞中β-整合素和角蛋白-19陽性率達90％以上；為皮膚缺損的快速修復、毛囊干細胞的生長與發生的分子機理研究、表觀遺傳學研究和重編程為誘導多能干細胞提供充足的種子細胞來源。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及干細胞領域，特別涉及。
技術介紹
根據細胞發育進程可將干細胞分為成體干細胞(adult stem cells)和胚胎干細胞(embryonic stem cells),根據干細胞的分化潛能等特點,可將干細胞可分為全能干細胞(totipotent stem cells)、多倉泛干細胞(pluripotent/multipotent stem cells)、專倉泛干細胞(unipotent stem cells)和終末分化細胞。全能干細胞可以分化形成人體所具有的全部細胞、或發育形成新的個體，是指在早期胚胎發育過程中的受精卵及受精卵進一步分裂形成2個、4個或8個卵裂球時期的細胞。多能干細胞(英文表述為pluripotent stem cells)可以分化形成人體所具有的全部細胞、但不能發育形成新的個體，主要存在于胚胎之中。在早期胚胎發育過程中，受精卵進一步分裂形成的桑椹胚，桑椹胚再進一步分化形成胚泡；胚泡的成胚體細胞，及在此階段以前的細胞，只要提取一個細胞，都可以可以分化形成人體所具有的全部細胞。另一概念上的多能干細胞(英文表述為multipotent stem cells)已經是上述細胞的發育更晚時期了，如各胚層的細胞、及造血干細胞。這些細胞可以分化成很多種細胞，如造血干細胞可以分化成各種白細胞、紅細胞、血小板等。單能干細胞或專能干細胞，只能分化成一種細胞，或者是分化成關系比較密切的兩種細胞(在特殊條件下也可以發生橫向分化)。 單能干細胞存在非常廣泛，在大部分組織器官都有存在。胚胎干細胞(embryonic stem cells, ES cells)是一種來源于早期胚胎、能在體外長期傳代培養、維持正常核型、具有自我更新和分化發育為3個胚層組織細胞潛能的多能性細胞。1981年英國Evans等人建立起第一個小鼠的用生化胚胎干細胞株。此后，科學家又相繼建立了豬、牛、綿羊、山羊、兔、水貂、倉鼠、恒河猴、狨等ES細胞系。為研究細胞分化、動物發育、建立相關研究模型、闡明基因功能等開辟了廣闊的研究空間。1998年，美國威斯康星大學Thomson教授，在征得胚胎所有者同意后，從做試管嬰兒剩余的胚胎中分離出胚胎干細胞，并在體外培養成功。同年，美國約翰-霍普金斯大學的Gearhart教授等人從早期(約6周)流產胚胎的卵巢和睪丸組織中分離出原始生殖干細胞，并建立了胚胎生殖干細胞系。隨著同源重組技術在小鼠等哺乳動物遺傳修飾動物模型中的廣泛應用、哺乳動物體細胞核移植技術的建立和日益完善、ES細胞在體外定向分化手段的日益多樣化和成熟，使得ES細胞在多個領域，如細胞治療、組織工程等方面展示了巨大潛力，被認為是細胞移植替代治療的未來的希望。2006年，Yamanaka等系統研究小鼠和人ESCs多潛能性相關因子時發現4個轉錄因子0ct4, Sox2, Klf4, c-Myc,將這四個因子導入鼠成纖維細胞后,成纖維細胞重編程形成ESCs類似的多能干細胞,被稱為誘導多能干細胞(mouse induced Pluripotent Stem cells, miPSCs)。2007 年 Yamanaka 和 Yu 等分別獨立建立了人 iPS 細胞系(human iPSCs,hiPSCs)。這一研究成果被譽為生命科學新的里程碑，它不僅為研究多能性的調控機制帶來了觀念上的創新和提供了新的研究模型，更為解決目前干細胞移植治療中最大難點之-移植后的免疫排異問題-開辟了新的途徑。iPSCs細胞在形態、多能性維持和分化潛能上與ESCs —致，且克服了 ESCs不可避免的倫理學爭議和異體細胞移植排斥等問題。因此， hiPSCs已逐漸代替hESCs成為未來臨床轉化醫學重要的細胞來源。近幾年來，研究者們陸續從多種細胞類型中重編程獲得hiPSCs細，如皮膚成纖維細胞、骨髓間充質干細胞、肝臟細胞和胃上皮細胞、神經前體細胞、胰島細胞、人皮膚和毛囊角質形成細胞、脂肪干細胞、羊水來源細胞、血液前體細胞、神經干細胞、臍帶血干細胞、臍帶華通膠和羊膜來源細胞、外周血T淋巴細胞等。這種通過活檢或其他借助外科手段獲取種子細胞制備患者特異性的iPS有望克服胚胎干細胞治療中所帶來的免疫排斥和深層的倫理學問題。上述不同的體細胞在hiPSCs重編程過程中有著不同的特點，并且上述方法在獲取所需要的種子細胞過程當中，因為要借助于活檢或抽血等手段，將會對患者造成一定程度上的損傷，所以需要一種新的微創或無創的方法獲取種子細胞，并且這種種子細胞能高效率地被再程序化為iPS細胞。
技術實現思路
針對
技術介紹
中的問題，本專利技術提供以下技術方案—種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法，其具體步驟為A、將準備拔取毛發的部位貼根部剪去至僅留O. 2-0. 3cm左右毛發根，75%酒精消毒 IOmin ；B、用清潔眉鑷快速將發根拔出，并快速置入無菌的PBS中漂洗；C、將單根毛發種入培養皿中，采用毛囊干細胞培養基培養；D、每天觀察毛發的生長情況，I周后每3-4天換液一次； E、逆轉錄病毒包裝采用試劑Fugene6和PLAT A細胞進行逆轉錄病毒的包裝，分別利用pMX-h0ct4、pMX-hSox2、pMX_hKlf4和pMX-hc_Myc包裝出四種逆轉錄病毒；F、通過逆轉錄病毒感染毛囊干細胞，促使其表達外源的人類0ct4、Sox2、Klf4和 c-Myc基因，誘導毛囊干細胞重編程為iPS細胞；G、毛囊干細胞來源的iPS細胞維持培養及鑒定。作為本專利技術的優選技術方案，，所述步驟A中小剪刀、鑷子及棉球臨用前滅菌， 最好準備一間無菌間，或經紫外滅菌的房間，或病人家中(臨時用70%的乙醇噴灑整個房間)；如采集頭發者，剪去耳后2cmX2cm大小面積的長發，僅留2-3毫米長的毛發，用70%的乙醇棉球擦除被剪毛發部分及周邊部分IOXlOcm大小面積，五min后再用70%的乙醇棉球擦一次。作為本專利技術的優選技術方案，，培養所述步驟C中的毛囊干細胞培養基為含1% B27、10ng/mL bFGF 和 50ng/mL EGF 的 DMEM/F12。作為本專利技術的優選技術方案，，所述步驟E中轉染前2天，準備4個IOOmm培養皿，各接種2 X 106個PLAT A細胞；轉染當天，4個IOOmm培養皿的PLAT-A細胞匯合度達到 70%，符合轉染所需細胞數量要求；取4個EP管，每個加300ul OPT1-MEM和27ul Fugene6，輕輕彈勻，室溫孵育 5min ;pMX_h0ct4、pMX_hSox2、pMX_hKlf4 和 pMX-hc-Myc 各 9 μ g 分別加至上述4個EP管內，充分混勻后，室溫孵育15min ;將上述4個EP管內混合液分別加至4 個IOOmm培養皿，輕輕搖勻培養皿后，放置在37°C，5% C02的溫箱進行培養；轉染24h后，4 個培養皿進行換液，各加IOmL不含雙抗的PLATA基本培養基；轉染48h后，收集4個含轉錄因子病毒上清至一個50mL離心管，混勻，約36mL ;收集上述病毒后用于感染毛囊干細胞。作為本專利技術的優選技術方案，，所述步驟F中用1:1 :1 :1的上述四種混合逆轉錄病毒感染提前24h準備的細胞總數為O. 5-1x105的成纖維細胞，并選用10ng/mL Polyb本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種培養擴增人類毛囊干細胞及重編程為誘導多能干細胞的方法，其特征在于，其具體步驟為：A、將準備拔取毛發的部位貼根部剪去至僅留0.2?0.3cm左右毛發根，75％酒精消毒10min；B、用清潔眉鑷快速將發根拔出，并快速置入無菌的PBS中漂洗；C、將單根毛發種入培養皿中，采用毛囊干細胞培養基培養；D、每天觀察毛發的生長情況，1周后每3?4天換液一次；E、逆轉錄病毒包裝：采用試劑Fugene6和PLAT?A細胞進行逆轉錄病毒的包裝，分別利用pMX?hOct4、pMX?hSox2、pMX?hKlf4和pMX?hc?Myc包裝出四種逆轉錄病毒；F、通過逆轉錄病毒感染毛囊干細胞，促使其表達外源的人類Oct4、Sox2、Klf4和c?Myc基因，誘導毛囊干細胞重編程為iPS細胞；

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：諶兵來，高擎，曾橋，
申請(專利權)人：諶兵來，高擎，曾橋，
類型：發明
國別省市：