本發(fā)明專利技術公開了一種誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞的誘導劑及培養(yǎng)基。該誘導劑，含有丹酚酸B。該培養(yǎng)基通過以下方法制得：將該誘導劑加入用于胚胎干細胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基；其中，所述誘導劑中的丹酚酸B在所述誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為10-6~10-3M。本發(fā)明專利技術還公開了該誘導劑和該培養(yǎng)基在誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞中的應用。本發(fā)明專利技術的誘導劑，無毒，具有誘導胚胎干細胞定向分化的作用，誘導分化后的功能心肌細胞可為心肌細胞移植療法提供合適的細胞供體。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及一種誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞的誘導劑、誘導分化培養(yǎng)基及其應用。
技術介紹
由心肌細胞功能障礙引起的心臟衰竭是世界范圍內(nèi)的一種主要的疾病，心衰患者最終死亡的原因主要是心臟泵血功能喪失或心律不齊。嚴重的心衰患者一年期死亡率超過50%。雖然晚期患者可以進行心臟移植，然而由于供體器官缺乏，約有20%的病人在等待器官移植的過程中死亡。由于心力衰竭的高發(fā)病率和死亡率、移植心臟的死亡、免疫排斥反應等并發(fā)癥以及移植心臟后期失效等客觀現(xiàn)狀，亟待發(fā)展新的治療方法以提高心肌細胞的功能，阻止心力衰竭的發(fā)生。目前對心力衰竭的治療方法主要集中于早期血管再生和抑制進 一步的心肌細胞損失，而心肌細胞是一種終端分化的細胞，增殖能力極其有限，損失后極難恢復。而心肌細胞移植療法著重于重建心肌功能，恢復再生心肌組織的泵血能力，也有研究發(fā)現(xiàn)注入心臟的心肌細胞能夠形成新的心肌組織。但細胞移植治療關鍵因素是確定合適的供體細胞類型。因此，如何誘導干細胞定向分化為心肌細胞以用于醫(yī)藥治療是亟待解決的技術難題。目前用于心肌細胞定向分化的主要分化方法、誘導劑及分化發(fā)生的可能機制如下1.自主分化 人胚胎干細胞(hESC)脫離滋養(yǎng)層細胞在體外懸浮培養(yǎng)10天形成EBs后貼壁培養(yǎng)4天后8. l%EBs出現(xiàn)自主收縮。具體分子機制仍不清楚，可能和細胞株類型、血清中的某些細胞因子、培養(yǎng)方式等因素有關。此種方法無需干預，但分化率極低，不能滿足為細胞移植提供供體的最終目的。2.藥物誘導 現(xiàn)在可以用作誘導劑的藥物有抗壞血酸C、維甲酸(retinoic acid, RA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)、5_ 氮 _2_ 脫氧胞苷(5-aza-2_deoxycytidine, 5-aza-dC)坐寸o此方法可以誘導胚胎干細胞向功能性心肌細胞分化，但多數(shù)現(xiàn)在應用的誘導劑均具有生物毒性，不適宜應用于臨床。維生素C (維甲酸)雖已廣泛應用于臨床，但也有報道長期過量服用可能導致草酸及尿酸結(jié)石，結(jié)石病人的使用受到局限。3.生理活性物質(zhì) 骨形成蛋白、催產(chǎn)素等生理活性物質(zhì)本身在體內(nèi)即具有重要的生理活性，體外研究可以很好的應用，但應用于臨床時具有一定的局限性。4.共培養(yǎng)方法 禽類的心前內(nèi)胚層/中胚層和mESC共培養(yǎng)、END-2細胞系和hESC共培養(yǎng)均可誘使胚胎干細胞向心肌細胞分化。此種方法的誘導分化機制是仿照生物發(fā)育調(diào)控機制中的胚胎誘導方式，分泌多種細胞因子，誘導ESC向中胚層心肌細胞方向分化。此方法可以模擬體內(nèi)干細胞的生存環(huán)境，不需要添加額外的誘導制劑，但對分化過程的調(diào)控及分離最終的功能細胞比較困難。5.轉(zhuǎn)基因的方式 目前的方法有轉(zhuǎn)染Nkx2. 5基因，心肌特異性a肌球蛋白重鏈啟動子和增強綠色熒光蛋白標記基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染a肌球蛋白啟動子聯(lián)合嘌呤毒素抗性基因、表皮生長因子基因和增強綠色熒光蛋白標記基因。該方法的機理是通過上調(diào)心肌細胞相關的特異性基因，激活心臟發(fā)育相關的信號傳導通路，誘導胚胎干細胞向心肌細胞分化。 轉(zhuǎn)基因安全性是需要首先考慮的問題之一，要做到這一點，必須使轉(zhuǎn)基因能在特定細胞中的表達受到精確的控制，表達過多過少均不能達到預期的效果。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術所要要解決的技術問題干細胞移植是一種新型治療手段，對于心肌梗死和心力衰竭的患者來說，如果能夠使移植的干細胞有效分化為心肌細胞則可以顯著改善其預后。多數(shù)干細胞誘導劑由于具有細胞毒性或體內(nèi)作用不可控而僅僅應用在干細胞體外實驗中，這對進一步提高干細胞移植療效提出了挑戰(zhàn)。如經(jīng)典的干細胞誘導劑5-氮胞苷是一種去甲基化藥物，它可使控制向心肌分化的特定調(diào)控基因阻遏蛋白去甲基化而發(fā)生構型改變，從而促進干細胞向心肌細胞分化。在5-氮胞苷的基礎上加入一些生長因子則能進一步提高分化效率，但由于具有較大毒性，很難應用于臨床。為了解決上述技術問題，本專利技術提供一種誘導劑具有誘導胚胎干細胞定向分化的作用，誘導分化后的功能心肌細胞可為心肌細胞移植療法提供合適的細胞供體。本專利技術的誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞的誘導劑，含有丹酚酸B。其中，所述的誘導劑，還可含有人參皂苷Rgl。其中，所述的誘導劑，還可含有人參總皂苷。本專利技術提供一種誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞的誘導分化培養(yǎng)基，所述誘導分化培養(yǎng)基通過以下方法制得將權利要求1所述的誘導劑加入用于胚胎干細胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基；其中，所述誘導劑中的丹酚酸B在所述誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為10-卜10_3M0優(yōu)選地，所述用于胚胎干細胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基由如下成分配制而成GMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，非必須氨基酸，IOOmM的丙酮酸鈉水溶液和KT1M的二巰基乙醇水溶液，其中GMEM培養(yǎng)基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸鈉水溶液二巰基乙醇水溶液的體積比=77.9:20:1:1:0.1。本專利技術還提供一種誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞的誘導分化培養(yǎng)基，所述誘導分化培養(yǎng)基通過以下方法制得將權利要求2所述的誘導劑加入用于胚胎干細胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基；其中，所述誘導劑中的丹酚酸B在所述誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為10-卜10_3M，人參皂苷Rgl在所述誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為5 X 10_6 10_3M。優(yōu)選地，所述用于胚胎干細胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基由如下成分配制而成=GMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，非必須氨基酸，IOOmM的丙酮酸鈉水溶液和KT1M的二巰基乙醇水溶液，其中GMEM培養(yǎng)基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸鈉水溶液二巰基乙醇水溶液的體積比=77. 9:20:1:1:0.1。本專利技術另提供一種誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞的誘導分化培養(yǎng)基，所述誘導分化培養(yǎng)基通過以下方法制得將權利要求3所述的誘導劑加入用于胚胎干細胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基；其中，所述誘導劑中的丹酚酸B在所述誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為10_6 10_3M，人參總皂苷在所述誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為7.8iig/mL 1.5mg/mL。優(yōu)選地，所述用于胚胎干細胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基由如下成分配制而成=GMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，非必須氨基酸，IOOmM的丙酮酸鈉水溶液和KT1M的二巰基乙醇水溶液，其中GMEM培養(yǎng)基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸鈉水溶液二巰基乙醇水溶液的體積比=77.9:20:1:1:0.1。 上述的誘導劑在誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞中的應用，包括胚胎干細胞體外培養(yǎng)形成擬胚體，取擬胚體于含有所述誘導劑的誘導分化培養(yǎng)基中，進行誘導分化培養(yǎng)，獲得心肌細胞。上述的誘導分化培養(yǎng)基在誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞中的應用，包括 1)將胚胎干細胞制成單細胞懸液； 2)懸滴培養(yǎng)將單細胞懸液細胞計數(shù)后用分化培養(yǎng)基將其稀釋成細胞濃度為10，105cellS/mL的胚胎干細胞懸液，接種于細菌培養(yǎng)皿的蓋子內(nèi)表面上，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿蓋子，使蓋子上的胚胎干細胞形成懸滴，培養(yǎng)皿中加入水或水溶液以保持懸滴在孵育過程中的濕度，培養(yǎng)皿置于5%C02，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)f 3天； 3)懸浮培養(yǎng)收集步驟2)培養(yǎng)皿蓋子上懸滴中形成的擬胚體，將其轉(zhuǎn)移到盛有分化培養(yǎng)基的細菌培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)懸浮，促使擬胚體進一步增殖； 4)將步驟3)制備好的擬胚體轉(zhuǎn)移到明膠包被的孔板，每孔一個擬胚體添加所述誘導分化培養(yǎng)基，開始干預分化培養(yǎng)。優(yōu)選地，步驟2)和步驟3)中本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞的誘導劑，其特征在于，含有丹酚酸B。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：羅國安，王義明，
申請(專利權)人：羅國安，
類型：發(fā)明
國別省市：
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