本發明專利技術提供肝素酶II在解聚肝素前體制備低分子量肝素中的應用，以及一種利用重組肝素酶II解聚肝素前體制備低分子量肝素的方法。本發明專利技術提供了肝素酶II在解聚肝素前體中的新用途，提供了一種肝素酶法制備LMWH的新途徑，該方法反應條件溫和，產品和酶易于分離，生產方便，具有重大應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及肝素酶Ii在解聚肝素前體制備低分子量肝素中的應用，以及一種利用重組肝素酶II解聚肝素前體制備低分子量肝素的方法。
技術介紹
肝素是有糖醛酸和D-氨基葡萄糖以α (I — 4)糖苷鍵連接而成的重復雙糖單位組成的糖胺聚糖家族中的一員，是具有不同鏈長即不同分子量的各種大小分子所組成的混合物，其分子量具有多分散性，一般在300(T30000D之間，平均分子量15000D(大約為45個單糖)。作為目前世界上使用最廣泛最有效的抗凝抗血栓試劑之一，它用于臨床診斷已有60 多年的歷史。但其副作用也越來越明顯，如大量的使用肝素會引起出血、骨質疏松等癥狀。低分子量肝素(Low Molecular Weight Heparin,LMWH)是分離肝素得到的一些組分或肝素裂解產生的小片段，它可以克服肝素的一些副作用而仍保持其抗凝抗血栓活性， 因此低分子量肝素在臨床上得到了廣泛的應用。英國藥典規定=LMWH是指重均分子量不得大于8000，分子量低于8000的物質不少于60%的肝素。目前LMWH常用制備方法包括物理分離法和化學裂解法，但其中收率低，環境污染問題卻不容忽視。肝素酶是自然界中唯一一類能夠特異性裂解肝素大分子中糖苷鍵的酶類，可以用來解聚肝素制備低分子量肝素，目前肝素黃桿菌(F. h印arinum)中已發現三種肝素酶 (Heparinase,簡稱Hep):肝素酶I,肝素酶II，和肝素酶III,各有其不同的底物特異性,主要是作用位點不同。目前大量的商業化低分子量肝素是通過以肝素酶部分解聚普通肝素獲得，這同樣有可能發生肝素污染等危機以及會出現肝素的硫酸化基團丟失或減少。肝素前體(Heparosan)是某些病原菌莢膜中的糖胺聚糖成分，表達式為 η (其中 GlcUA 是葡萄糖醛酸；GlcNAc 是葡萄糖乙酰胺)，是構成大腸桿菌K5和巴斯德菌D型的莢膜多糖的成分，利用巴斯德菌D型產生的 hepa rosan的分子量為200 300 KDa,而利用大腸桿菌K5產生的heparosan的分子量為 3^150 KDa，更接近于肝素的分子量大小。因此，利用大腸桿菌K5莢膜多糖h印arosan作為前體合成肝素以及硫酸乙酰肝素得到人們的廣泛關注。由于酶的特異性，目前肝素酶僅用于解聚肝素，還未有以肝素酶對肝素前體進行解聚的報道。
技術實現思路
本專利技術目的是提供肝素酶II解聚肝素前體制備低分子量肝素中的應用，并提供一種利用重組肝素酶II解聚肝素前體制備低分子量肝素的方法。本專利技術采用的技術方案是肝素酶II在解聚肝素前體(Heparosan)制備低分子量肝素(Low Molecular Weight Heparin, LMWH)中的應用。具體的，所述應用為以肝素前體為反應底物，加入肝素酶II進行解聚，解聚后的產物再經進一步常規脫乙酰、硫酸化和異構化修飾，制得所述低分子量肝素。雖然肝素前體的多糖骨架與肝素多糖骨架類似，但是未將葡萄糖醛酸異構化為艾杜糖醛酸，也未硫酸化修飾，因此，解聚后的產物需再經進一步脫乙酰、硫酸化和異構化修飾，才能獲得本專利技術低分子量肝素。脫乙酰方法指利用氫氧化鈉脫去N-乙酰葡萄糖胺的乙酰基；硫酸化指通過與三甲基銨三氧化硫共聚物和碳酸鈉反應在脫乙酰位硫酸化；所述異構化，是指利用C5-異構酶將D-GlcA異構化為L-1doA。優選的，所述解聚在25°C下進行，反應時間1. 5h。優選的，所述解聚在緩沖液中進行，緩沖液組成如下乙酸鈉100 mM, BSA O. 01%, 乙酸鈣10 mM，溶劑為水，ρΗ7· O。優選的，所述肝素酶II為重組肝素酶II。本專利技術還涉及一種利用重組肝素酶II解聚肝素前體制備低分子量肝素的方法， 所述方法包括(I)根據已報道Flavobacterium heparinum肝素酶 II 基因序列(Genbank access number U27585.1)和氨基酸序列(Genbank access number AAB18277.1)設計引物，從肝素黃桿菌基因組DNA擴增得到肝素酶II基因片段，克隆到pET-15b表達載體中，獲得重組載體 pET15b-h印B，pET15b-h印B 轉化 E. coli BL21 (DE3)獲得重組菌 E. coli BL21(DE3) /pET15b-hepB,重組菌經乳糖誘導后，菌液經細胞破碎后提取目標蛋白，獲得重組肝素酶 II ;(2) Heparosan與重組肝素酶II在緩沖液中于25°C下反應1. 5h,反應液經分離純化，得到解聚后的Ifeparosan ;所述緩沖液組成為乙酸鈉100 mM, BSA O. 01%,乙酸鈣10 禮，溶劑為水，ΡΗ7· O ;緩沖液中Ifeparosan初始濃度為O. θΓθ. lg/mL，重組肝素酶II初始添加量為10(T500U/mL ；(3)解聚后的Heparosan進一步進行脫乙酰、硫酸化和異構化反應,制得所述低分 子量肝素。具體的，所述脫乙酰、硫酸化方法可如下解聚后的Ifeparosan溶解于f 3M氫氧化鈉溶液，在6(T90°C下反應3飛h，反應液進一步稀釋，冷卻并用鹽酸調PH至7，再一步加入羧酸鈉和三甲基銨三氧化硫共聚物反應12h后再加入等體積的羧酸鈉和三甲基銨三氧化硫共聚物在50°C繼續反應12h。反應液冷卻至室溫，3500 Da截留分子量cellulose membrane透析過夜,透析液凍干即獲脫鹽、 N-硫酸化 heparosan。具體的，所述異構化方法可如下20^160 ng/ml C5 差向異構酶(C-5 印imerase，C5Epi)和適量底物在含 0. 05 M Hepes, 0. 015 M EDTA,0.1 M KCl, 0. 05% TritonX-100，ρΗ7· 4 的反應系統中混合，并在37°C 反應30分鐘。然后加入冷的0.05 M醋酸鈉、0.05 M LiCl至pH 4. O停止反應，反應混和液進行DEAE-cellulose柱層析純化，即得所述低分子量肝素。本專利技術的有益效果主要體現在提供了肝素酶II在解聚肝素前體中的新用途，提供了一種肝素酶法制備LMWH的新途徑，該方法反應條件溫和，產品和酶易于分離，生產方便，而且酶可以反復使用，可進一步節約成本，具有重大應用前景。附圖說明圖1為Heparinase II表達情況驗證；A中Iane1:標準蛋白分子量標記(MBI) ；lane 2、3 :無和有IPTG誘導的LB培養基培養菌體總蛋白；lane 4、5 :無和有IPTG誘導的LB培養基培養菌體超聲裂解后上清液；B中Iane1:標準蛋白分子量標記(MBI); Iane 2 :無IPTG誘導LB培養基培養的菌體總蛋白；lane3:乳糖自誘導培養基培養的菌體總蛋白；lane 4:乳糖自誘導培養基培養的菌體超聲裂解后上清液5 :乳糖自誘導培養基培養的菌體超聲裂解后細胞碎片。圖2為Heparinase II的N1-NTA親和層析效果；Iane I, 7:標準蛋白分子量標記(MBI);lane 2 :無IPTG誘導LB培養基培養的菌體總蛋白lane 3:乳糖自誘導培養基培養的菌體總蛋白；lane 4:乳糖自誘導培養基培養的菌體超聲裂解后上清液；lane 5 :乳糖自誘導培養基培養的菌體超聲本文檔來自技高網...
【技術保護點】
肝素酶II在解聚肝素前體（Heparosan）制備低分子量肝素（Low?Molecular?Weight?Heparin，LMWH）中的應用。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：鐘衛鴻，吳石金，黃海嬋，邱樂泉，鐘莉，呂沈聰，趙雷，嚴子琴，王暢，
申請(專利權)人：浙江工業大學，
類型：發明
國別省市：
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