脂質體的兩相制備方法及其在制造診斷試劑中的應用技術

本發明專利技術涉及脂質體的兩相制備方法，在其過程中，使用技術上簡單和廉價的機械混合方法混合包含天然磷脂和合成磷脂的單獨混合物的非極性有機相和與其不混溶的極性水（緩沖液）相，合成具有獨特結構的脂質體乳劑。此外，本發明專利技術包括關于當不使用任何洗滌劑將蛋白類型活性成分錨定到脂質體膜的表面，并且非蛋白類型活性成分與具有獨特結構的脂質體乳劑簡單混合時，以這種方式制備的脂質體的體外診斷用途的方法的實施方式。在一個可能的方法的實施方式中，制備凝血酶原時間(PT)試劑。在另一個可能的方法的實施方式中，制備激活部分促凝血酶原激酶時間(APTT)試劑。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及脂質體的兩相制備方法，在其過程中，使用技術上簡單的機械方法混合包含天然磷脂和合成磷脂的單獨混合物的非極性有機相和與其不混溶的極性水(緩沖液)相。當活性組分錨定到脂質體膜的表面時，用本方法制備的具有獨特結構的脂質體乳劑優選體外應用。此外，本專利技術可能的實施方式涉及體外血液凝固診斷試劑的制備。在本專利技術的一組實施方式中，所述試劑由我們的提供用于活性組分和蛋白類型的活性組分的膜表面的具有獨特結構的脂質體乳劑，即天然或重組組織因子，組成。在這個組的可能的實施方式中， 在初步制備的脂質體上實現將蛋白錨定到膜表面。在這個組進一步可能的實施方式中，蛋白的錨定與脂質體膜表面的組裝同時進行。在另一組實施方式中，所述試劑由我們的具有獨特結構的脂質體乳劑和與所述乳劑通過簡單的機械混合混合的非蛋白類型的可溶活性組分組成。非蛋白類型的可溶活性組分可為有機酸或無機化合物(例如，鞣花酸、鞣酸、蕓香苷、槲皮苷或無機二氧化硅)。本專利技術的主題為方法，作為其中可能的實施方式，制備了體外血液凝固診斷試劑。 通過我們的方法制備的所述體外血液凝固診斷試劑適于測量凝血酶原時間和激活部分促凝血酶原激酶時間。本說明書的進一步的主題為上述方法可能的商業實現。
技術介紹
血液凝固診斷中最常用的進行的測量目的為測定凝血酶原時間(PT)和激活部分促凝血酶原激酶時間(APTT)。兩種診斷方法監控血液凝固系統的酶過程，以顯示檢測的有機體的止血狀態。血液凝固是一個由復雜的增多和減少的生化步驟組成的級聯型酶鏈反應。血液凝固系統的酶反應中決定性的多數為包括蛋白和非蛋白類型分子(酶和輔因子)和膜組分的膜結合過程。膜組分的主要構成為起基本結構(錨定)和功能(例如酶活性輔因子)作用的極性和非極 性脂質。為在體外系統中模擬體內膜結合過程，膜功能可被脂質化的特定過程支持，為體內系統提供合適的脂質成分。根據本專利技術，體外血液凝固診斷試劑中含脂質的組分為脂質體，即具有小于微米范圍的直徑的脂囊泡，其與合適組成的水溶液形成穩定的乳劑。所述脂質體提供體外血液凝固診斷反應所必需環境的膜表面，即它們適于錨定有機化合物(例如具有合適氨基酸序列的天然或重組蛋白)并適于與具有合適結構的有機或無機化合物結合。此外，脂質體膜的表面在錨定的活性蛋白或可溶活性無機化合物的表面活性反應中起到輔因子的作用。PT和APTT測量旨在確定作為血液凝固系統的中心步驟的血漿纖維蛋白原的聚合時間，即非活性凝血素變化為活性凝血酶時間。PT測量利用所謂的促凝血酶原激酶的凝血啟動效應，即所謂外在凝血途徑的起始 [Mackman N.等，(2007) =Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 27 :1687 至 1693]。促凝血酶原激酶包括含在磷脂膜中的組織因子(TF，凝血因子III)。組織因子為與膜重疊的跨膜糖蛋白[Bazan J. F. (1990) :PNAS 87,6934-6938.]。雖然健康個體的循環血液中的組織因子的可檢測水平有爭議[Monroe D. Μ.，Key N. S. (2007) :J. Thromb. Haemost. 5:1097-1105.]， 當血管床損傷時，膜結合的組織因子由沿損傷的細胞(例如內皮細胞和白細胞)釋放，從而啟動血液凝固級聯反應。釋放的膜結合組織因子結合并激活凝血因子VII，因此膜結合組織因子起到激活的凝血因子Vila的輔因子和受體的作用。膜結合組織因子和激活的凝血因子VIIa在Ca2+離子存在下促進凝血因子X的激活。由凝血酶原酶復合體觸發凝血素轉變為凝血酶，凝血酶原酶復合體由激活的凝血因子X (即因子Xa)和激活的凝血因子V (即因子Va)組裝，后者起到調節蛋白的作用。凝血酶將纖維蛋白原蛋白鏈裂解成纖維蛋白單體。 凝血酶還激活因子XIII ;激活的因子XIIIa形成轉谷氨酰胺酶家族的連接酶，起到纖維蛋白的穩定因子的作用。在激活的纖維蛋白穩定因子XIIIa的影響下，通過共價交聯由纖維蛋白單體產生纖維蛋白聚合物，即穩定的纖維蛋白網絡(Edgington T. S.等，(1991):組織因子的表達和功能的結構生物學，Thrombosis and Haemostasis,66 :67_79)。如上述，促凝血酶原激酶為包含錨定到合適組成的脂質膜的組織因子的膜復合體。此外，與環繞脂質膜結合的蛋白的存在是在時間和空間上血液凝固級聯反應的啟動中的關鍵。通過動物 或人富含脂質的內皮組織與水溶液的均勻化，產生絕對多數現有的PT試劑。然而，在一些先進的產品中，應用與人造脂質結構結合的含重組組織因子的促凝血酶原激酶。在APTT測定中，激活級聯反應的啟動不需要任何組織因子組分(部分促凝血酶原激酶)，但是由具有凈負電荷的活性成分(二氧化硅，有機酸)和脂質膜觸發。已知用于生產血液凝固診斷試劑的方法在制備膜組分，即脂質體，的方法方面彼此不同。在所有用于生產PT試劑的方法中，通過混合在表面活性劑物質(洗滌劑)的幫助下保存于溶液中的組織因子和預制的脂質體分散體制備促凝血酶原激酶[該方法在美國專利5625036、美國專利5314695、美國專利6124110、美國專利6733985、美國專利7049087 和美國專利7148067中說明]。由于存在的比例大于0. 05%的洗滌劑抑制血液凝固反應， 通過合適的分離方法即透析[參考例如美國專利5314695 ;美國專利4622188 ;美國專利 6124110 ;和美國專利6733985]、超濾[美國專利5625036 ;和美國專利5314695]或吸附方法[如在美國專利7049087 ;和美國專利7148067中說明]，從體系中去除表面活性劑。去除洗滌劑的過程，即當洗滌劑的濃度達到其最終值時，應通過進行幾個生產中測定檢查。除了增加程序的步驟之外，使用洗滌劑一個很大的缺點為洗滌劑自身和/或用于去除其的步驟的高成本。已知的方法中，用于生產脂質體的方法[例如在美國專利4622188中]基于這樣的現象，即在合適極性的溶液中，根據物理化學環境，同時具有極性和非極性分子部分的表面活性物質形成單層或多層囊泡。“A” 一最常使用的用于生產脂質體經典方法為所謂的干膜方法[在美國專利 4438052 ;美國專利5556637 ;和美國專利7169410中說明]。在這個方法中，第一個步驟為將脂質溶于有機溶劑。然后，用真空或惰性氣體流將溶劑從溶液中完全蒸發。最終將在容器壁上形成的干脂質膜分散于合適的水溶液中。通過充分混合[例如在美國專利6296870 中說明的方法]和/或超聲粉碎[參考美國專利5234634]制備來自該分散體的最終脂質體乳劑。這些已知的方法基本上形成具有相當寬的尺寸分布的多層脂質體。通過在提供窄的粒徑分布和單片層或雙片層囊泡的高壓裝置上擠壓所述未加工的分散體，可實現合適尺寸分布和優選的迭片結構。擠壓方法在九十年代廣泛使用[這種方法的實例在美國專利 4529561 ;美國專利5204112 ;和美國專利6926905中說明]。根據所含脂質的溶劑的水混溶性，混合溶劑的方法可分成兩類。在使用可與水混溶的溶劑的情況下，所述方法被稱為單相方法[一個實例為美國專利 6261792]?！癇” 一在單相方法中，脂質溶于極性有機溶劑，通常本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種脂質體的兩相制備方法，在所述方法的過程中，混合包含天然和合成磷脂混合物的非極性有機相和與所述非極性有機相不混溶的極性水(緩沖液)相，并產生具有50至IOOnm粒徑的脂質體乳劑，其特征在于用一種簡單的機械方法生產所述脂質體乳劑，其中，用溶于所述非極性有機相中并呈現正曲率或零曲率的O. 5至1. 5g/ml濃度的脂質分子的單獨混合物產生完全包圍所述有機相的單層或雙層脂質體膜的結構，所述脂質分子為例如卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿和更少量的天然來源的其它磷脂，這樣，以這種方式制備的具有獨特結構的所述脂質體乳劑的所述膜表面優選適于錨定活性成分。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于將2 I比例的氯仿-甲醇混合物用作非極性有機相。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于在所述非極性有機相中，為生產呈現正曲率或零曲率的脂質分子的所述單獨混合物，優選提供55°C的溫度和pH=2的環境。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于在所述極性水相中，用有機化合物，優選0.025M三(羥甲基)甲基甘氨酸，提供所述緩沖效果。5.如權利要求4所述的方法，其特征在于用5MNaOH將所述極性水(緩沖液)相的pH值調節在pH=6和pH=7之間、優選pH=6. 6，并以O. 05M的濃度補充抗菌NaN3防腐劑。6.如權利要求1至5的任一項所述的方法，其特征在于在制備所述具有獨特結構的脂質體乳劑的過程中，將較小體積的所述非極性有機相加入到較大體積的所述極性水(緩沖液)相中，所述較大體積為所述較小體積的5至50倍大,最優選20倍。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于在室溫(25°C)下將相簡單搖動到一起，所述相為在所述極性水(緩沖液)相下分層的所述非極性有機相。8.如權利要求6所述的方法，其特征在于由于攪拌元件的旋轉運動，較大體積的所述相在室溫被帶入渦旋運動，然后將較小體積的所述相注入、噴射或最優選滴入所述渦旋中。9.如權利要求6所述的方法，其特征在于通過離心旋轉所述混合容器將較大體積的所述相在室溫帶入渦旋運動，然后將較小體積的所述相注入、噴射或最優選滴入所述渦旋。10.如權利要求7至9的任一項所述的方法，其特征在于通過沉降、過濾或離心去除與不與水混溶的所述制造的成品的組分。11.制備體外凝固診斷凝血酶原時間(PT)的試劑的方法，所述試劑的一種成分為用根據權利要求1至10的任一項所述的方法制造的脂質體，其特征在于在制備所述PT試劑的過程中，不使用任何洗滌劑，將蛋白類型的活性組分組織因子錨定到所述具有獨特結構的脂質體的所述膜表面。12.如權利要求1至11的任一項所述的方法，其特征在于所述具有獨特結構的脂質體組分在預備生產步驟中生產。13.如權利要求12所述的方法，其特征在于所述活性成分為從天然來源分離的組織因子。14.如權利要求12所述的方法，其特征在于所述活性成分為通過發酵生產的重組組織因子。15.如權利要求13或14所述的方法，其特征在于所述天然或重組組織因子(活性成分)優選使用O. 5至1. O μ M的濃度。16.如權利要求1至15的任一項所述的方法，其特征在于包含所述具有獨特結構的脂質體乳劑的所述溶液與所述天然或重組組織因子(活性成分)混合到一起，并靜置優選10分鐘。17.如權利要求16所述的方法，其特征在于所述脂質體乳劑與所述組織因子以2 I的比例混合。18.如權利要求17所述的方法，其特征在于通過用合適組成的緩沖液稀釋來調節通過混合具有獨特結構的脂質體乳劑和組織因子并靜置而生產的產品的最終血液凝固特性。19.如權利要求18所述的方法，其特征在于具有合適組成的緩...

【專利技術屬性】
技術研發人員：約瑟夫·安托，佐爾坦·瓦伊達，舒茲桑納·陶卡奇，貝亞塔·納吉，
申請(專利權)人：戴阿岡有限公司，
類型：
國別省市：