用于細(xì)菌總DNA內(nèi)含物的特異性分離方法和用于該分離目的的試劑盒技術(shù)

本申請(qǐng)公開(kāi)了用于不同樣品的細(xì)菌總DNA內(nèi)含物的特異性分離方法，在所述方法的過(guò)程中，裂解所述細(xì)胞，選擇性結(jié)合所述裂解物的DNA內(nèi)含物，洗滌所述DNA內(nèi)含物，然后在水溶液中從所述結(jié)合表面上洗提所述脫鹽的直鏈聚合核苷酸。在細(xì)胞裂解之前，基于非活細(xì)菌細(xì)胞和活細(xì)菌細(xì)胞不同的細(xì)胞表面的物理-化學(xué)特性，將所述非活細(xì)菌細(xì)胞從所述活細(xì)胞中分離，將所述樣品的所述活細(xì)胞保存然后用機(jī)械和/酶的方法裂解，優(yōu)選溶菌酶的方法。此后，將源自活細(xì)胞的所述裂解物的雙鏈DNA專(zhuān)門(mén)結(jié)合在含有化學(xué)激活的-OH和十二烷胺基團(tuán)的-SiO2-TiO2-基質(zhì)上，洗滌之后，在水溶液中所述洗提脫鹽的直鏈聚合核苷酸。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】
本專(zhuān)利技術(shù)的主題是一種用于不同來(lái)源樣品的細(xì)菌總DNA內(nèi)含物的特異性分離方法以及一種用于實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)該方法的試劑盒。
技術(shù)介紹
在飲用水、環(huán)境水、食品、工作區(qū)、不同的公共和環(huán)境表面的公共健康衛(wèi)生監(jiān)測(cè)方面，所收集樣品的微生物測(cè)試的重要部分是細(xì)菌的定性和定量測(cè)定。對(duì)于上述測(cè)定而言一除了選擇性或非選擇性培養(yǎng)基上的體外培養(yǎng)和它們的顯微檢測(cè)以外，以及除了為單個(gè)細(xì)菌新陳代謝步驟而精心進(jìn)行的生化反應(yīng)以外一目前多種基于核酸的分子診斷方法也是可行的，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)核酸序列的體外擴(kuò)增、或揭示核酸堿基序列的排序方法、或測(cè)試所得核酸片段的瓊脂糖凝膠電泳方法 與傳統(tǒng)方法不同，這些核酸類(lèi)的分子診斷方法使得分析即使在少量首批樣品的情況下也能夠進(jìn)行。這些核酸類(lèi)的分子診斷方法的模板是具有實(shí)際使用的分析方法所需的濃度和純度的細(xì)菌核酸。然而，這兩個(gè)參數(shù)，核酸的濃度和純度會(huì)隨著所用的預(yù)分析方法而變化，即隨著樣品破碎和核酸提取的方法而變化。為得到模板核酸的樣品破碎為多步驟方法，在該方法中，適合當(dāng)前用途的單獨(dú)步驟可以分別進(jìn)行或彼此結(jié)合。通常，破碎始于細(xì)胞裂解，接著在隨后的步驟中進(jìn)行選擇性結(jié)合-靶向脫氧核糖核酸(DNA)的提取和純化，然后以純化分離的核酸的定性和定量測(cè)定結(jié)束方法。在確定合適的PH值、溫度和離子條件時(shí)，可以機(jī)械地(例如通過(guò)溶脹、超聲破解、粉碎進(jìn)行破碎)，化學(xué)地(例如用含有酶、表面活性劑、洗滌劑、離子螯合劑的緩沖液)，在蛋白改性和細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核酸酶抑制添加劑的聯(lián)合復(fù)合物中，進(jìn)行破碎。在沉淀-提取、離心、電泳或色譜法的幫助下，可以從破解得到的裂解物中分離并純化靶向核酸。例如通過(guò)測(cè)量在紫外波長(zhǎng)(UV)誘導(dǎo)的DNA插入聚芳染色(例如溴化乙啶)的熒光發(fā)射，可以進(jìn)行從細(xì)胞大分子和進(jìn)一步的細(xì)胞碎片中純化的核酸產(chǎn)物的半定量分析。在用UV分光光度法在波長(zhǎng)λ26(ι處測(cè)量的光密度(OD)的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行分離的核酸的定量分析。一個(gè)OD單元相當(dāng)于50 μ g/ml的DNA濃度。為了定義分離的DNA的純度，使用了在兩個(gè)不同UV波長(zhǎng)處測(cè)量的光密度比(OD26tl/OD28tl),即在核酸水溶液和蛋白水溶液的特征波長(zhǎng)處(λ 26(|和λ28(ι)測(cè)量的光吸收比。優(yōu)選地，OD260/OD280的比值在I. 4至2. O的范圍內(nèi)變化。較小值顯示了蛋白污染(例如細(xì)胞裂解物的殘留蛋白組分)，而較大值(>2)顯示了分光光度測(cè)量誤差或其他可能的污染。當(dāng)使用PCR時(shí)，優(yōu)選地0D26Q/0D28Q比應(yīng)該在I. 4至I. 8之間。在日常的公共健康實(shí)踐方面，最普遍地是使用苯酚-氯仿混合物分離細(xì)菌DNA, MDNA可以用易與水混合的有機(jī)溶劑分離，例如用異丙醇分離。上述有機(jī)溶劑在破碎和分離的方法中毫無(wú)疑問(wèn)是有效的，但是它們威脅實(shí)驗(yàn)室工作人員和環(huán)境的潛在毒性卻不容忽視。避免使用上述有機(jī)溶劑的相當(dāng)常用的解決方法為，在破壞生物樣品之后還向分離基因組DNA內(nèi)含物的緩沖液體系中加入離液序列高的組分。由于離液序列高的組分使蛋白質(zhì)改性(例如NaJ、KJ、Na-高氯酸鹽、鹽酸胍_GC、硫氰酸胍-GTC)以及合適的pH值水平，與蛋白結(jié)合的核酸分解，且核酸降解核酸酶的功能性抑制促進(jìn)了有效的DNA分離。美國(guó)專(zhuān)利4900677記載了適用于革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌破碎的方法，之后使用不含有機(jī)溶劑的溶液以快速方法將綠膿桿菌和糞鏈球菌的染色體DNA內(nèi)含物與其它物質(zhì)分離。為了提取染色體DNA，在包含具有不同目標(biāo)光譜的酶(溶解酵素、內(nèi)-N-乙酰-溶菌酶、消色肽酶等)、溶解劑(例如二甲基亞砜、二甲基甲酰胺)、表面活性劑(例如十二烷基硫酸鈉、TritonX-100、CHAPS、CHAPSO)和離子螯合劑(例如EDTA)組分的基于pH=8. O的Tris緩沖液的混合物中，通過(guò)渦流混合將初始IO7-IO8細(xì)胞團(tuán)破碎。用核糖核酸酶(RNase)消化污染核糖核酸(RNA)物質(zhì)，且通過(guò)加入蛋白酶K中和剩余的酶蛋白物和非酶蛋白物。向體系中加入支 持DNA分離的離液序列高的組分(例如Na-三氟醋酸鹽、Na-高氯酸鹽、NaJ)，然后使用火棉膠膜透析純化將近一小時(shí)得到的DNA。通過(guò)改變反應(yīng)溫度(37° C和60° C)進(jìn)一步促進(jìn)樣品破碎和剩余蛋白的中和。根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利5595876，在革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性菌的所謂原位單管DNA提取過(guò)程中，通過(guò)提高溫度也可以促進(jìn)殘留蛋白的中和。如上所述，在破碎和分離的過(guò)程中成功地避免了有機(jī)溶劑的使用，但是提取的產(chǎn)量和分離的DNA純度卻降低了。通過(guò)一種間接方法試圖提高DNA產(chǎn)量，該方法通過(guò)在堿性緩沖介質(zhì)中(例如pH=8至9)加入少量易與水混合的有機(jī)溶劑而促進(jìn)DNA的選擇性分離。在美國(guó)專(zhuān)利5945515中，在一個(gè)真核細(xì)胞實(shí)例中，通過(guò)加入少量有機(jī)溶劑將RNA物質(zhì)從也在堿性緩沖液中含有離液序列高組分(GTC)的細(xì)胞裂解體系中初步沉淀，然后用離心分離沉淀物，從而將要分離的DNA選擇性地留在溶液中。在該專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)進(jìn)一步的實(shí)例中，為了加快上述DNA分離，在數(shù)量上減少然后省略了離心步驟。在分析以此獲得DNA的純度時(shí)，還在瓊脂糖凝膠電泳法中檢測(cè)到了 RNA殘留污染物。除了以上常規(guī)的和間接的分離方法以外，約二十年來(lái)，實(shí)踐中按照不同原理操作的DNA分離的其他替代方法已經(jīng)變得越來(lái)越廣泛。實(shí)際上，這些替代方法中的一類(lèi)在生物大分子的分離方面使用了色譜原理。這些方法都是基于原理細(xì)胞裂解后，裂解物的DNA物選擇性地且可逆地結(jié)合在載體表面上。這些載體可以為過(guò)濾物(硝基纖維素、尼龍、醋酸纖維素、金屬氧化物)、塑料(PVDF)或玻璃(硅膠 Si02、SiO2-TiO2)類(lèi)的基質(zhì),或者可以為通過(guò)結(jié)合不同離子和聚合物得到的微粒和珠子，在載體的使用過(guò)程中，破碎和DNA提取的步驟可以自動(dòng)進(jìn)行。WO 專(zhuān)利 2004033707 記載了 Na-硅酸鹽載體的使用，WO專(zhuān)利第2004046231號(hào)記載了在真核線(xiàn)粒體DNA CmtDNA)或全血DNA內(nèi)含物的分離過(guò)程中，結(jié)合到聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯載體(試管、微板孔)的二氧化硅、硅膠的使用。在記載于WO專(zhuān)利1998023630中的單步方法中，羥化的芳香疏水聚合物、聚羥基苯乙烯的作用被描述為保留細(xì)胞裂解物的污染組分，同時(shí)核酸隨著洗提液離開(kāi)。WO專(zhuān)利2002000930記載了在胍鹽 的幫助下，從應(yīng)用于尼龍或愈瘡木浸入的載體的糞便涂片樣品中提取DNA，而在美國(guó)專(zhuān)利20080319182中通過(guò)提供特殊的陽(yáng)離子表面而確保DNA結(jié)合。用可逆的二級(jí)結(jié)合和對(duì)載體的選擇性特征，在獨(dú)特的物理-化學(xué)條件(溫度、離心力、電解質(zhì)條件等)下，將包括DNA的核酸結(jié)合在這些載體的表面。從溶液中清除具有結(jié)合在其表面的DNA的載體后，且在合適的脫鹽后，通過(guò)從載體洗提DNA可以分離所結(jié)合的DNA。對(duì)于下游分子應(yīng)用(例如PCR、酶消化、排序、電泳等)而言，分離的DNA的最重要的參數(shù)為純度(參見(jiàn)下文)、量(濃度μ g/ml)和完整/片段，即分子的物理維持。使用上述有機(jī)溶液的常規(guī)提取方法的優(yōu)點(diǎn)是較令人滿(mǎn)意的純度(OD26tlA)D28tl指數(shù)=1. 4-1. 7)和較大的濃度(>50 μ g/ml)。其缺點(diǎn)在于殘留溶劑會(huì)干擾敏感的下游分子應(yīng)用(例如水解探針定性的實(shí)時(shí)PCR、微陣列)，還在于分離方法耗時(shí)(最少I(mǎi).本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：加博·基斯，亞諾什·基斯，卡塔林·斯通奇克，喬治娜·貝爾納特，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：戴阿岡有限公司，
類(lèi)型：
國(guó)別省市：