在植物中表達蛋白質制造技術

在植物中表達蛋白質本發明專利技術涉及在植物中生產流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步驟：將流感H5基因或編碼其功能等價物的核酸克隆到適于靶向植物中存在的組分的載體中，用所述載體侵入植物的至少一部分，或者用所述載體轉化植物組織，以瞬時表達所述流感病毒H5多肽和/或產生轉基因植物；和回收由所述植物表達的流感病毒H5多肽。本發明專利技術還涉及在所述方法中使用的或者作為所述方法的結果產生的載體、轉基因植物或其部分和這樣的植物的子代。

【技術實現步驟摘要】
在植物中表達蛋白質本專利技術是國際申請號PCT/ZA2006/000063，國際申請日為2006年5月2日，進入中國國家階段日期為2007年10月26日，中國國家申請號為200680014202. 5，專利技術名稱為“在植物中表達蛋白質”的分案申請。
技術介紹
本專利技術涉及在植物中表達蛋白。特別地，本專利技術涉及轉基因蛋白表達和高產量蛋白生產的細胞內定位的方法。本專利技術還涉及在植物中生產人乳頭瘤病毒(HPV)蛋白和/或流感病毒H5蛋白。本專利技術還涉及評估蛋白在植物內表達的快速機制。應用轉基因植物進行異源蛋白的大規模生產正逐漸獲得廣泛的接受，并且可能成為疫苗蛋白節約成本生產的平臺。產生轉基因植物研究一大類蛋白和/或表達載體的表達特征并不總是可行的，原因在于這一程序費時的本質。相反，瞬時表達系統能夠快速評估各種不同的蛋白在各種植物物種中的蛋白表達。關于應用轉基因植物進行大規模蛋白生產的另一個問題通常是生產的異源蛋白的令人失望的低水平。植物質體，特別是葉綠體，已經成功地被表達異源蛋白的重組載體轉化，以顯著地增加植物中由每份總可溶蛋白所產生的蛋白水平(參見，例如，W02005/011367和W02004/005467A2)。質體還能夠輸入各種分子，包括蛋白。存在不同的方法，通過這些方法發生分子輸入，一個這樣的方法涉及與質體的類囊體膜相互作用。異源蛋白靶向質體是一種顯著增加蛋白在植物細胞內的積聚的機制。許多年來一直應用農桿菌(Agrobacterium)介導的基因轉移來產生穩定的轉化植物。這種方法包括將T-復合物(一種由農桿菌T-DNA和毒力基因產物形成的復合物)從農桿菌菌株轉移到植物細胞(Zupan等.，2000)。將位于限定單鏈T-DNA的25bp同向重復序列(左和右邊界)之間的任何DNA轉運到植物細胞核中(Zupan等.，2000)，在這里它通過不正常重組而整合到植物染色體上(Somers和Makarevitch, 2004)。在所述核內存在的許多T-DNA拷貝沒有結合，但是得到轉錄，這引起瞬時表達。瞬時表達不受位置效應的影響，并且可以產生比穩定轉化顯著更高的外源蛋白水平(Kapila等.，1997)。通常應用兩種農桿菌侵入(農桿菌侵入法)方法注射和真空侵入。農桿菌注射包括直接注射到葉片的遠軸氣室，而葉片仍然附著在植物上(Voinnet等.，2003)。在真空侵入過程中，對農桿菌混懸液應用真空，葉片浸沒在所述混懸液中(Kapila等.，1997)。盡管通常只在少數葉片上進行，但是這一技術可以規模化Medicago Inc. (Quebec, Canada)的研究者每周能夠進行農桿菌侵入多達7500片苜蓿葉片，并且Stefan Schillberg及同事(Institute for Molecular Biotechnology,RffTH Aachen,Germany)已經進行了農桿菌侵入了多達100kg的煙草葉片(Twyman 2004)。農桿菌介導的瞬時表達在侵入后60到72小時達到最大,然后由于轉錄后基因沉默(PTGS)而迅速下降(Voinnet等.，2003)。PTGS或RNA干擾是一種適應性抗病毒抵御反應，其限制病毒在植物中 的復制和傳播。這一過程包括在胞質中識別靶點RNA和起始序列-特異性RNA降解途徑(Voinnet，2001)。某些植物病毒編碼具有抑制PTGS能力的沉默阻抑制子。這些沉默抑制蛋白中的一些，諸如番茄斑萎病毒(TSWV)的NSs (Takeda等，2002)，和番爺叢矮病毒的pl9 (Voinnet等.，2003)已經用來延長和擴增農桿菌介導的瞬時表達，其通過包含沉默抑制基因的農桿菌的共同侵入而進行。對于將商購蛋白在植物中的表達優化以達到使植物成為可行平臺的水平存在需求。具體地，存在對于在植物中生產HPV蛋白和/或流感病毒H5蛋白的方法的需求。還存在對載體、轉基因植物或其部分和這樣的植物的子代的需求以實現如前文所述的需要。專利技術概述按照本專利技術的第一方面，提供一種在植物中生產HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的方法，其包括步驟1.將HPV基因和/或流感病毒H5基因或編碼它們的功能等價物的核酸克隆到適于靶向植物中存在的成分的載體中；2.用所述載體侵入至少植物的部分，或者用所述載體轉化植物組織，以瞬時表達HPV多肽和/或流感病毒H5多肽，和/或產生轉基因植物；和3.回收由植 物表達的HPV多肽和/或流感病毒H5多肽。術語‘植物’意欲包括缺少專門的感覺器官和自主運動能力的所有生命有機體。同樣地，所述定義包括單子葉植物和雙子葉植物以及所有的光合生物。術語‘HPV多肽’意欲包括HPV LI蛋白；與另一 HPV抗原肽融合的嵌合HPV LI肽；與衍生于任何抗原表位、B細胞或T細胞特異性的異源肽融合的嵌合HPV LI肽以及HPVL2蛋白或它們的功能等價物。已作必要的修正，同樣的意思適用于術語‘HPV基因’。術語‘植物成分’意欲包括質體、內質網、細胞質和質外體。優選地所述植物成分是質體。靶向意指載體中可以包含靶向序列。這樣的靶向序列可被翻譯成肽，所述肽將載體或其產物導向植物中需要的成分，諸如質體。按照本專利技術的載體優選地包括可操作性地連接到編碼序列上的啟動子和其它必需調節子，諸如終止子等。應該理解用載體侵入植物的至少一部分可以引起蛋白的瞬時表達，并且用載體轉化植物組織以產生轉基因植物可以引起蛋白的轉基因表達，意欲這兩種形式的表達都屬于本申請的范圍。在本說明書中，提及蛋白、肽或基因或它們的功能等價物包括提及其變體，所述變體能夠很大程度上行使與蛋白、肽、多肽或基因相同的功能。優選地，本專利技術涉及HPV-16L1蛋白的生產；與另一 HPV抗原肽融合的嵌合HPV LI肽；與衍生于任何抗原表位、B細胞或T細胞特異性的異源肽融合的嵌合HPV LI肽；HPV L2蛋白；或流感病毒H5蛋白。優選地，所述載體是二元載體，更優選地為根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) 二兀載體。所述載體可以適于靶向質體，其通過使得所表達的多肽包括能夠與質體的類囊體膜特別是類囊體膜的轉運結構相互作用的部分而進行。這一相互作用可以使得多肽從其所表達的細胞質輸入到質體中。輸入到細胞質的機制對于蛋白的正確折疊可能是重要的。然而，應該理解所述載體可以適于靶向要轉化的質體本身，并且多肽的表達可以完全在質體內發生。不希望受到理論局限，本申請人認為進入到質體的多肽以其一級結構進入，并且在質體內進行折疊成其二級和三級結構，即，遠離細胞的細胞質。同樣地，本申請人認為通過載體表達多肽可以發生在質體內，然后在其中它采用其二級和三級結構是專利技術原理的合理外延。換句話說，本申請人認為專利技術原理延伸到質體的轉化。在這樣的條件下，蛋白的表達完全發生在質體內，并且不與細胞的細胞質接觸。優選地，所述HPV LI基因；與另一 HPV抗原基因融合的嵌合的HPVLl基因；與衍生于任何抗原表位、B細胞或T細胞特異性的異源基因融合的嵌合HPV LI基因；HPV L2基因；或流感病毒H5基因是優化的基因，例如，人密碼子優化的，BCG密碼子優化的或植物密碼子優化的。HPV LI基因或HPV LI嵌合體的基因還可以以另一種方式修飾，例如，核定位信號缺失。按照本專利技術的方法還可以本文檔來自技高網...

【技術保護點】
在植物中生產流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步驟：i)將流感病毒H5基因或編碼其功能等價物的核酸克隆到適于靶向植物中存在的組分的載體中，其中所述植物組分選自由內質網和質外體組成的組；ii)用所述載體侵入所述植物的至少一部分，或者用所述載體轉化植物組織，從而瞬時表達所述流感病毒H5多肽，和/或產生轉基因植物；和iii)回收由所述植物表達的流感病毒H5多肽。

【技術特征摘要】
2005.04.29 ZA 2005/034541.在植物中生產流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步驟 i)將流感病毒H5基因或編碼其功能等價物的核酸克隆到適于靶向植物中存在的組分的載體中，其中所述植物組分選自由內質網和質外體組成的組； )用所述載體侵入所述植物的至少一部分，或者用所述載體轉化植物組織，從而瞬時表達所述流感病毒H5多肽，和/或產生轉基因植物；和 iii)回收由所述植物表達的流感病毒H5多肽。2.權利要求1的方法，其中一個或多個靶向序列包含于所述載體中，所述靶向序列編碼將所述流感病毒H5多肽從細胞質導向所述植物組分的多肽。3.權利要求1或權利要求2的方法，其中所述載體包括可操作地與所述載體的編碼序列連接的啟動子和其它調節子等。4.前述權利要求任一項的方法，其中所述載體是二元載體，優選根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) 二兀載體。5.前述權利要求任一項的方法，其中所述流感病毒H5基因是密碼子使用優化的基因，優選人密碼子使用優化的基因、BCG密碼子使用優化的基因或植物密碼子使用優化的基因。6.前述權利要求任一項的方法，其還包括用在植物中適于抑制轉錄后基因沉默的抑制蛋白共同侵入所述植物的步驟，所述抑制蛋白如番茄斑萎病毒的NSs蛋白或番茄叢矮病毒的 P19。7.前述權利要求任一項的方法，其中所述侵入通過直接注射或通過真空進行。8.前述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：安娜莉澤·威廉森，愛德華·彼德·雷比茨基，詹姆斯·馬爾科姆·麥克萊恩，因加·伊莎貝爾·貝克爾希策爾奧特，
申請(專利權)人：開普敦大學，
類型：發明
國別省市：