一種用于嚴重膿毒血癥及急性肝衰竭的檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術屬免疫學技術領域，涉及一種用于嚴重膿毒血癥及急性肝衰竭的檢測試劑盒。所述的檢測試劑盒包括：含枸櫞酸鈉的抗凝管、紅細胞裂解液、PBS溶液、CD45人單克隆抗體、CD14人單克隆抗體、CD16人單克隆抗體和1％多聚甲醛固定液。本檢測試劑盒可通過檢測單核細胞分化能力，對膿毒血癥及急性/慢加急肝衰竭患者外周血的檢測，用于判斷所述疾病的轉歸。檢測結果表明，所述疾病的單核細胞分化能力同樣存在障礙；外周血單核細胞分化阻抑與疾病轉歸密切相關：存在單核細胞分化阻抑的患者死亡率明顯升高，而存在單核細胞分化阻抑的患者經治療后，若出現分化阻抑消失則顯示其轉歸可存活。本檢測試劑盒為進一步治療方案的制定提供有積極意義的參考數據。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬免疫學
，涉及ー種用于嚴重膿毒血癥及急性肝衰竭的檢測試劑盒，該試劑盒可通過檢測單核細胞分化能力，對膿毒血癥及急性/慢加急肝衰竭患者外周血的檢測，用于判斷所述疾病的轉歸。
技術介紹
嚴重膿毒血癥(severe sepsis)和急性/慢加急性肝衰竭(acute/acute onchronic liver failure)屬于危重癥疾病范疇,其特點為疾病均存在至少ー個主要臟器的功能衰竭及嚴重的免疫系統紊亂，死亡率高。迄今為止，臨床尚無能有效測定所述疾病轉歸的診斷試劑盒。醫學上，嚴重膿毒血癥的定義為在系統性全身炎癥反應綜合征(systeminflammatory response syndrome, SIRS)基礎上出現第一個臟器功能衰竭48小時后的患者即為嚴重膿毒血癥。急性(Acute liver failure, ALF) /慢加急(Acute on chronicliver failure, ACLF)肝衰竭的定義為原來無肝病(ALF)或原有慢性肝炎或肝硬化病變基礎(ACLF)的患者，在短期內因嚴重肝細胞損害而導致肝功能衰竭井/或出現肝性腦病為特征的肝衰竭癥候群；該疾病患者進展迅速，死亡率高達60 % -70 %以上。嚴重膿毒血癥和急性/慢加急性肝衰竭進展期均存在持續性代償性抗炎反應綜合征(CARS)，機體免疫系統處于嚴重的抑制狀態；持續高強度的CARS (免疫麻痹)是機體免疫功能紊亂的ー種病理狀態，進入免疫麻痹狀態后，患者易發生二次感染，加速病情惡化，并可導致多器官功能衰竭(MODS);因此，持續、嚴重的CARS是提示嚴重膿毒血癥及肝衰竭患者轉歸不佳的關鍵因素。目前尚無能有效預測上述疾病轉歸的有效手段，但目前通常采用的尋找疾病轉歸標志方法，是通過免疫抑制嚴重程度(CARS嚴重度)的水平來反映疾病預后。作為先天性和適應性免疫門戶的單核細胞(monocytes)是抑炎因子(IL-10)的主要靶細胞，CARS持續狀態下單核細胞功能障礙是嚴重膿毒血癥及急性/慢加急性肝衰竭患者免疫麻痹的重要特征?？乖岢使δ堋⒓毎只芰胺置谘装Y因子(TNFa )能力為單核細胞主要的三種功能。有研究發現其抗原提呈功能的抑制程度具有預測嚴重膿毒血癥及急性/慢加急性肝衰竭轉歸的能力。Antoniades等在分析50例急性藥物性肝衰竭進展期患者后發現，當單核細胞HLA-DR表達下降至〈15% (健康者為70%左右)時患者預后不良的準確率高達98%。Wasmuth等對27例肝硬化(50%病因為酒精性)基礎上發生的慢加急性肝衰竭進展期患者研究后也提示單核細胞HLA-DR表達持續下降是免疫抑制狀態下疾病預后的有效指標。因此，在持續性CARS環境下研究單核細胞功能變化是探索急性/慢加急性肝衰竭進展期轉歸預測的重要方向。目前急需ー種通過檢測單核細胞分化情況，對膿毒血癥及急性/慢加急肝衰竭患者外周血進行檢測，用于判斷上述患者轉歸情況的檢測試劑盒。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種用于嚴重膿毒血癥及急性肝衰竭的檢測試劑盒，該試劑盒可通過檢測單核細胞分化能力，對膿毒血癥及急性/慢加急肝衰竭患者外周血的檢測，用于判斷所述疾病的轉歸。尤其是，該試劑盒通過檢測單核細胞分化情況，對膿毒血癥及急性/慢加急肝衰竭患者外周血進行檢測，用于判斷上述患者轉歸不良(死亡)還是轉歸良好(存活)。本專利技術中，所述的嚴重膿毒血癥的定義為在SIRS基礎上出現第一個臟器功能衰竭48小時后的患者，第一個臟器可包括肺臟、肝臟、腎臟、腦、心等；本專利技術中的實施例中以肝臟或肺臟作為第一個累及臟器，但并不局限與肝臟或肺臟。具體而言，本專利技術的用于嚴重膿毒血癥及急性肝衰竭的檢測試劑盒，其特征在干，包括但不局限于以下組成 含枸櫞酸鈉的抗凝管、紅細胞裂解液、PBS溶液、CD45人單克隆抗體、CD14人單克隆抗體、CD16人單克隆抗體和I %多聚甲醛固定液； 所述的CD45、CD14、CD16人單克隆抗體的濃度范圍為0. 00001 u g/ml — 100mg/ml ;在本專利技術的實施例中，所述的⑶45、⑶14、⑶16人單克隆抗體濃度優選為25 ii g/ml。本專利技術中，所述試劑盒的檢測流程至少包括以下步驟 (1)采集3ml患者外周靜脈血放入含枸櫞酸鉀的抗凝管內， 本專利技術中優選是立即進入檢測流程，若不能立即檢測，室溫保存應不超過4小時，保存期間避免劇烈震蕩； (2)取200微升上述全血種于外周血96孔板中的一孔，共6孔； (3)置于37°C，5%C02的孵箱中孵育48小時； (4)分別取0，12，24，32，36及48小時培養后的全血加入紅細胞裂解液1ml， 本專利技術中優選取36小時培養后的全血加入紅細胞裂解液； (5)800g離心,棄上清； (6)加入IxPBS洗滌后，再800g離心一次；(7)加入2微升⑶45、2微升⑶14及3微升⑶16人單克隆抗體孵育15— 30分鐘； (8)離心，IxPBS洗滌一次； (9)加入1%多聚甲醛固定； (10)4°C保存，流式細胞儀上機檢測，獲得在⑶45+范圍內⑶14highCD16 monoycte，CD14hlghCD16+monoycte 的流式圖。本專利技術所述檢測流程的步驟(I)中采集外周靜脈血的方式選自首次或后續或動態采集外周血。本專利技術中，分化阻抑與分化成功的判斷標準為所述的流式圖中以CD14highCD161nonoycte 為 Mol, CD14highCD16+monoycte 為 Mo2，以培養 36 小時的外周血中M02/M01>1. 0為分化成功，以Mq2/Mq1〈1. 0為分化阻抑。采用本專利技術的檢測試劑盒對收集的四十多例嚴重膿毒血癥及急性/慢加急肝衰竭患者外周血進行檢測，對所述的四十多例嚴重膿毒血癥及急性/慢加急肝衰竭患者外周血單核細胞的抗原提呈能力與預后關系進行分析，還對單核細胞的分化功能及產生TNFd的分泌能力進行了全面的研究分析，結果表明，嚴重膿毒血癥和急性/慢加急肝衰竭患者的單核細胞分化能力同樣存在障礙；研究結果還顯示，外周血單核細胞分化阻抑與疾病轉歸密切相關存在單核細胞分化阻抑的患者死亡率明顯升高，而存在單核細胞分化阻抑的患者經治療后，若出現分化阻抑消失則顯示其轉歸可存活。研究分析結果表明，本專利技術的檢測試劑盒可通過檢測單核細胞體外分化情況預測所述疾病的轉歸，為進一步治療方案的制定提供參考數據。本專利技術的檢測試劑盒具有以下優點 (1)本檢測試劑盒可檢測嚴重膿毒血癥疾病患者轉歸，其中，嚴重膿毒血癥疾病患者的第一個臟器包括肺臟、肝臟、腎臟、腦、心臟、血管系統、胰腺等； (2)本檢測試劑盒檢測嚴重膿毒血癥疾病患者轉歸包括轉歸良好(存活)及轉歸不良(死亡)兩類； (3)本檢測試劑盒可檢測急性重癥肝衰竭患者轉歸，包括急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭以及亞急性肝衰竭的轉歸； (4)本檢測試劑盒檢測急性重癥肝衰竭疾病轉歸分為轉歸良好(存活)及轉歸不良(死亡)兩類； (5)本檢測試劑盒用于檢測急性重癥肝衰竭疾病轉歸預測時，當患者外周血單核細胞分化成功則預測患者可能轉歸良好(存活)，當患者外周血單核細胞出現分化阻抑，則預測患者可能轉歸不良(死亡); (6)本檢測試劑盒用于嚴重膿毒血癥疾本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于嚴重膿毒血癥及急性肝衰竭的檢測試劑盒，其特征在于，包括但不限于以下組成：紅細胞裂解液、PBS溶液、CD45人單克隆抗體、CD14人單克隆抗體、CD16人單克隆抗體和1％多聚甲醛固定液。

【技術特征摘要】
1.一種用于嚴重膿毒血癥及急性肝衰竭的檢測試劑盒，其特征在于，包括但不限于以下組成 紅細胞裂解液、PBS溶液、CD45人單克隆抗體、CD 14人單克隆抗體、CD 16人單克隆抗體和1%多聚甲醛固定液。2.按權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的CD45、CD14、CD16人單克隆抗體的濃度范圍為 O. OOOOl μ g/ml 一 100mg/ml。3.按權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的CD45、CD14、CD16人單克隆抗體的濃度為25 μ g/ml ο4.一種檢測膿毒血癥及急性/慢加急肝衰竭患者外周血單核細胞分化能力的方法，其特征在于，采用權利要求1的檢測試劑盒，至少包括以下步驟 (1)采集3ml患者外周靜脈血放入含枸櫞酸鉀的抗凝管內； (2)取200微升上述全血種于外周血96孔板中的一孔，共6孔； (3)置于37°C，5%C02的孵箱中孵育48小時； (4)分別取0，12，24，32，36及48小時培養后的全血加入紅細胞裂解液Iml； (5)800g離心,棄上清； (6)加入IxPBS洗滌后，再800g離心一次；(7)加入2微升⑶45、2微升⑶14及3微升⑶16人單克隆抗體孵育15— 30分鐘； (8)離心，IxPBS洗滌一次； (9)加入1%多聚甲醛固定； (10)4°C保存，流式細胞...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李海，
申請(專利權)人：李海，
類型：發明
國別省市：