一種早期診斷膀胱癌的試劑盒及其制備方法技術

本發明專利技術涉及生物醫學免疫分析領域，本發明專利技術利用微孔板化學發光免疫分析法，通過檢測人尿液中的膀胱癌腫瘤標志物——異常糖基化的整合素AG-α3β1建立一種快速、靈敏、高特異性的早期診斷膀胱癌的檢測試劑盒。本發明專利技術的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、高特異、穩定等優點，可用于常規體檢中膀胱癌早期篩查及膀胱癌跟蹤觀察和預后評價，可滿足目前膀胱癌體外診斷方面缺乏特異診斷方法的需要。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種膀胱癌患者尿液中的腫瘤標志物的檢測方法，該方法通過定量檢測存在于尿液中異常糖基化的整合素AG-α 3β I含量，無創性地實現膀胱癌的早期診斷。
技術介紹
膀胱癌為泌尿系最常見的惡性腫瘤，發病率在美國被列為男性惡性腫瘤的第四位，女性為第八位，居惡性腫瘤的第七位。在我國發病率泌尿系腫瘤第一位。膀胱癌約95%來源于膀胱上皮，絕大多數為惡性，只有少數為良性，包括乳頭狀瘤、移行細胞癌、鱗狀細胞癌和腺癌。其中以移行細胞癌最常見，占80%以上。目前手術治療、放療和化療的療效并不令人滿意，患者5年存活率在40% -60%。預后較差和極易復發是膀胱癌的最大特點，有效的治療很大程度上依賴于對膀胱癌的早期發現和早期治療。然而，膀胱癌發病隱匿，大部分 患者都是因為肉眼或鏡下血尿懷疑膀胱癌才會到醫院就診，而出現肉眼血尿往往已是癌癥晚期。所以尋找特異的膀胱癌早期診斷方法具有重要的臨床應用價值。目前，膀胱癌的早期診斷方法有以下幾種I)尿液分析血尿出現后首先便是進行尿液分析，以便排除是否是由于尿路炎癥引起，并不能確定患者是否患膀胱癌；2)尿脫落細胞分析對尿沉渣中的尿脫落細胞進行顯微鏡下觀察，可以鑒別并區分惡化的腫瘤細胞和正常細胞。但靈敏度不高，且差異較大，早期膀胱癌容易漏檢；3)超聲、CT或者MRI成像觀察對腫瘤的大小和惡化程度可以直接進行圖像觀察，準確度較前面方法大大提高。盡管近年來成像技術的不斷進步，靈敏度不斷提高，但對較小的腫瘤觀察仍然不夠，易漏檢；4)膀胱鏡觀察膀胱鏡通過尿路進入膀胱，進行可視化的觀察，從而發現早期的腫瘤并取活檢。但該方法是一種有創性檢查，不能用于膀胱癌早期篩查環節。目前早期診斷膀胱癌細胞特異性最高的是通過膀胱鏡的觀察，熒光膀胱鏡的應用提高了檢測靈敏度。但患者一般需要經常性的跟蹤觀察，從而能及早發現腫瘤，或者跟蹤治療中的療效及復發狀況的觀察。然而，膀胱鏡觀察會對患者造成身體不適。另外，目前熒光膀胱鏡檢測所需熒光染料特異性不高，且對人體有一定的負面影響。因此，在膀胱癌的早期診斷方面，人們一直在探索更特異和更靈敏的檢測方法，盡可能的利用特異的腫瘤標志物實現方便、快速的檢測。實現尿液中膀胱癌標志物或者細胞的檢測，進行實時檢測在臨床診斷方面具有重要的應用價值。目前商業化的可用的膀胱癌的標志物有人補體因子H相關蛋白(膀胱腫瘤抗原，BTA試劑盒)、高分子量的癌胚抗原和兩個膀胱癌細胞相關的粘附分子(美國ScimedxCorp公司的Immunocyt試劑盒)、核基質蛋白22 (ΝΜΡ22)、3、7和17號染色體的異倍體以及Ρ16腫瘤抑制因子9ρ21位點的缺失(UroVysion試劑盒)。BTA是指人補充因子H相關蛋白，BTA檢測需要專業操作人員在標準實驗室進行。靈敏度達到57-83%，特異性60-92%，血尿患者的特異性只能達到46%，另外良性前列腺增生、腎結石以及尿路感染等情況均影響BTA檢測的特異性；Immunocyt試劑盒通過免疫熒光檢測尿脫落細胞，盡管靈敏度以及特異性很高，但為了達到較高的準確性需要進行大量的尿脫落細胞檢測，因此在膀胱癌患者的治療以及預后觀測方面具有很高的應用價值，但應用在早期診斷方面差強人意；其中NMP22是目前應用最廣的膀胱癌標志物，ELISA試劑盒的市場化實現了膀胱癌早期診斷的方便、快捷檢測，檢測靈敏度和特異性也很高，但是在有病毒感染、腎/膀胱結石等情況下，仍會出現假陽性；Ur0Vysi0n試劑盒采用的是多靶標的熒光原位雜交(FISH)技術，盡管靈敏度與特異性得到極大提高，美國FDA批準，但與Immunocyt試劑盒類似，需要進行大量的尿脫落細胞檢測。結合目前的膀胱癌標志物的應用以及膀胱癌的診斷現狀，我們得出一方面，新的特異的膀胱癌仍是研究的重點；制備早期診斷試劑盒，實現快速、高通量檢測，在膀胱癌的早期篩查及預后方面具有重要的臨床價值。 因此，選用高特異性、高靈敏性且無創傷性的檢測方法對膀胱癌的早診、早治有重要意義。
技術實現思路
根據本專利技術人之前的研究(參見中國專利申請號201010251384. 6)，發現了一種人膀胱癌腫瘤標志物AG- α 3 β 1，其為異常糖基化的整合素α 3 β 1，其特征在于帶有作為抗原表位的糖結構[30S03]Galbl-4(Fucal-3) [60S03]GlcNAc。在上述中國專利申請號201010251384. 6中，公開了所述整合素α3β1的α 3亞單位的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示，所述整合素α 3β I的β I亞單位的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示，優選所述異常糖基化是處在α 3亞單位的第740位的氨基酸T (蘇氨酸)上。在中國專利申請號201010251384. 6中，本專利技術人通過以人膀胱癌細胞系T24(ATCC HTB-4)免疫Balb/C小鼠(商購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，將致敏的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，用ELISA方法篩選出針對人膀胱癌腫瘤標志物AG- α 3 β I的一株雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株于2010年5月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號為CGMCC No. 3845。通過同樣的方法，本專利技術人還獲得了單抗BCMab3，其為特異性識別人膀胱癌腫瘤標志物AG_a3i3 I蛋白C端的單克隆抗體，分泌單抗的雜交瘤細胞株于2012年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京市朝陽區北辰西路I號院3號，100101)，保藏號為CGMCC No. 6907。(一)本專利技術解決的技術問題本專利技術著眼于膀胱癌的早期診斷與膀胱癌患者的跟蹤觀察，擬解決現行的膀胱癌早期診斷方面的難題，即采用特異性識別膀胱癌腫瘤標志物AG-a 3β I的兩株單克隆抗體，利用雙抗體夾心法實現對AG-a 3β I的識別與捕獲，結合高靈敏的化學發光免疫分析方法，提供了一種高靈敏、高特異、操作簡便、價格適宜的定量檢測AG_a3i3 1的化學發光免疫試劑盒。該試劑盒不需要昂貴的檢測儀器，便于臨床推廣，具有良好的市場應用價值，將會彌補市場現有試劑盒的不足。本專利技術的目的是提供一種定量檢測AG- a 3 β I化學發光免疫分析試劑盒，很好的解決了檢測靈敏度和特異性低而影響膀胱癌早期診斷的問題。本專利技術的另一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。(二)技術方案1.本專利技術試劑盒組分本專利技術定量檢測AG-α 3β I化學發光免疫分析試劑盒，其組分包括如下Α.標準品。其是化學發光值很高的膀胱癌患者尿液樣本的逐級稀釋物。凍存備用。B.捕獲抗體BCMab3包被的微孔板。BCMab3為單克隆抗體，能特異地識別尿液中的AG- α 3 β I，將該抗體包被在微孔板上，用于特異性捕獲尿液中的AG- α 3 β I。C.用于檢測的標記抗體。該抗體為酶標記的針對AG-α 3β I的單克隆抗體 BCMabl，能特異地識別尿液中的AG-a 3β I。此單抗可用堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶偶聯形成酶聯單抗結合物。用其識別樣品中的AG-α 3β 1，釋放信號。其釋放信號能被轉換成為Α6_α3β1的濃度，用于定量分析。D.配置堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶所作用的化學發光底物液。Ε本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測(人尿液中)膀胱癌腫瘤標志物(異常糖基化的整合素AG?α3β1)的(化學發光)免疫分析試劑盒，其包括：特異性識別膀胱癌腫瘤標志物AG?α3β1的兩種單克隆抗體，優選鼠源單克隆抗體，更優選BCMab3和BCMab1，最優選用作捕獲抗體的BCMab3和酶標記的單克隆抗體BCMab1。

【技術特征摘要】
1.一種檢測(人尿液中)膀胱癌腫瘤標志物(異常糖基化的整合素AG-α 3β I)的(化學發光)免疫分析試劑盒，其包括 特異性識別膀胱癌腫瘤標志物AG-a 3β I的兩種單克隆抗體，優選鼠源單克隆抗體，更優選BCMab3和BCMabI，最優選用作捕獲抗體的BCMab3和酶標記的單克隆抗體BCMabl。2.如權利要求1所述的化學發光免疫分析試劑盒,其包括 1)標準品； 2)捕獲抗體BCMab3包被的微孔板； 3)酶標記的單克隆抗體BCMabl； 4)上述酶所作用的化學發光底物； 5)濃縮洗滌液； 6)陰性對照，為不含膀胱癌腫瘤標志物AG-α 3 β I的正常人全尿樣本；和 7)陽性對照，為含有膀胱癌腫瘤標志物AG-α 3 β I的膀胱癌患者全尿樣本。3.如權利要求1所述的化學發光免疫分析試劑盒，其中所述標準品為膀胱癌患者尿液樣本的逐級稀釋液。4.如權利要求1所述的化學發光免疫分析試劑盒，其中所述捕獲抗體BCMab3為特異性識別人膀胱癌AG- α 3 β I蛋白C端的單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 6907的雜交瘤細胞株分泌，優選其中所述微孔板為適用于化學發光反應的檢測的96孔(白色)微孔板。5.如權利要求1所述的化學發光免疫分析試劑盒，其中所述單克隆抗體BCMabl為抗人膀...

【專利技術屬性】
技術研發人員：范祖森，杜穎，李翀，張倩云，王彥英，楊昭，周鵬，
申請(專利權)人：中國科學院生物物理研究所，
類型：發明
國別省市：