一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法技術

本發(fā)明專利技術提供了兩種酶聯(lián)免疫吸附法檢測生物樣品和非生物樣品中鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）含量的方法。一種是人工抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量，一種是半抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量。兩種方法都是利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，樣品中DBP和包被抗原與DBP單克隆抗體競爭結(jié)合，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應和抑制率計算而得到DBP的含量。本發(fā)明專利技術可以一次處理大量樣品，靈敏度高，方便快捷，穩(wěn)定性好，成本低廉，特異性強。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法，屬于生物

技術介紹
近年來在許多國家和地區(qū)，塑化劑對食品、環(huán)境的污染引起了人們強烈的擔憂。鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)屬于苯二甲酸酯類化合物，被普遍應用于塑料制品、膠水、油漆、指甲油、洗發(fā)水和沐浴液等數(shù)百種產(chǎn)品中。鄰苯二甲酸二丁酯是半揮發(fā)性化合物，不與終產(chǎn)品共價結(jié)合，在生產(chǎn)和生活中，被不斷地釋放到大氣、土壤和水環(huán)境中。環(huán)境中的鄰苯二甲酸二丁酯又通過呼吸、飲食、皮膚接觸等三種途徑進入人體。因此，人類正面臨著越來越高的鄰苯鄰苯二甲酸二丁酯暴露風險。有研究報告指出我國普通人群DBP日攝入量為12. 2ug/kg bw,高于世界平均水平。動物模型研究和流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸二丁酯可以引起雄性生殖發(fā)育的障礙。鄰苯二甲酸酯還具有免疫毒性，能導致兒童產(chǎn)生哮喘、濕疹、鼻炎等持久性過敏癥。此夕卜，鄰苯二甲酸二丁酯還能能導致糖尿病、肥胖癥等。因此，鄰苯二甲酸二丁酯檢測已成為食品安全、環(huán)境監(jiān)測、毒理學研究等領域的重要工作。由于鄰苯二甲酸二丁酯在水環(huán)境、生物體內(nèi)的含量較低，常常在檢測域以下，因此鄰苯二甲酸二丁酯的含量分析是一件非常困難的工作。早期用含同位素14C的DBP飼喂實驗動物，然后檢測體內(nèi)組織中的放射性水平來評價DBP的水平。但是由于DBP在生物體內(nèi)降解快，所檢測到的放射量只是DBP和降解代謝物的總體水平，并不能代表DBP在生物組織內(nèi)的真正含量。現(xiàn)在DBP的分析多采用氣相色譜(GC)、HLPC、GC-質(zhì)譜聯(lián)用法等色譜分析技術，但這些技術需要進行樣品前處理等，耗時多，并且有較高的儀器要求，色譜柱等耗材價格昂貴，此外，還需要操作人員有豐富的經(jīng)驗。免疫分析由于選擇性強、靈敏度高，一次可檢測多種樣品，因此把免疫分析技術應用于DBP檢測具有簡便、快速、成本低的優(yōu)點。張明翠等用一種DBP的多克隆抗體，通過免疫組化法分析了水和包裝的食品中DBP的含量。Yanaihara等運用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)分析了鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的含量。但是，這兩個研究都是基于多克隆抗體的免疫分析。多克隆抗體對抗原的專一選擇性、靈敏度上都不及單克隆抗體。多克隆抗體受限于實驗動物，不能無限制的獲取。此外，由于從不同動物個體中獲取的多克隆抗體的選擇性、靈敏度、效價等都不同，因此用多克隆抗體建立同一標準的免疫分析方法就很困難。
技術實現(xiàn)思路
針對現(xiàn)有技術的不足，本專利技術所要解決的技術問題是提供操作簡便、靈敏度高的檢測鄰苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法。本專利技術提供兩種酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測生物樣品和非生物樣品中鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)含量。一種是人工抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量，一種是半抗原包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量。本專利技術所提供的方法之一是 利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，樣品中DBP和包被抗原DBAP-BSA競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應和抑制率計算，而得到DBP的含量。 上述方法具體包括如下步驟 1)DBP單克隆抗體的制備； 2)抗體效價的測定 將人工抗原DBAP-BSA于酶標板中包被、封閉，與不同稀釋度的DBP單克隆抗體結(jié)合，后續(xù)加酶標二抗，顯色，終止，用酶標儀測定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O處抗體稀釋度為單克隆抗體的工作濃度； 3)標準抑制曲線的建立 將人工抗原DBAP-BSA于酶標板中包被，封閉，不同濃度DBP標準溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標二抗，顯色，終止，用酶標儀測定492nm處的吸光度，以抑制率為縱坐標，DBP濃度為橫坐標，建立抑制率標準曲線； 4)測定樣品抑制率，通過抑制標準曲線確定樣品中DBP含量 將人工抗原DBAP-BSA于酶標板中包被，封閉，樣品溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標二抗，顯色，終止，用酶標儀測定492nm處的吸光度，計算出抑制率，通過抑制率標準曲線確定樣品中DBP含量。上述方案中，所述DBP單克隆抗體制備過程如下人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠，取免疫小鼠脾細胞與瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞并克隆化；小鼠腹水法大量制備單克隆抗體；再通過硫酸銨沉淀法純化DBP單克隆抗體。上述方案中，將人工抗原DBAP-BSA于酶標板中包被的過程為用包被緩沖液將人工抗原DBAP-BSA稀釋到O. 25 μ g/ml或O. 5 μ g/ml, 100 μ L/孔加入酶標板中，同時設置加有100 μ L包被緩沖液的對照孔，4°C過夜。本專利技術所提供的方法之二是 利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，樣品中DBP和包被半抗原DBAP競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應和抑制率計算，而得到DBP的含量。上述方法具體包括如下步驟 1)DBP單克隆抗體的制備； 2)抗體效價的測定 將半抗原DBAP于酶標板中包被、封閉，與不同稀釋度的DBP單克隆抗體結(jié)合，后續(xù)加酶標二抗，顯色，終止，用酶標儀測定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O處抗體稀釋度為單克隆抗體的工作濃度； 3)標準抑制曲線的建立 將半抗原DBAP于酶標板中包被，封閉，不同濃度DBP標準溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標二抗，顯色，終止，用酶標儀測定492nm處的吸光度，以抑制率為縱坐標，DBP濃度為橫坐標，建立抑制率標準曲線；4)測定樣品抑制率，通過抑制標準曲線確定樣品中DBP含量將半抗原DBAP于酶標板中包被，封閉，樣品溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標二抗，顯色，終止，用酶標儀測定492nm處的吸光度，計算出抑制率，通過抑制率標準曲線確定樣品中DBP含量。上述方案中，將半抗原DBAP于酶標板中包被過程為 a.酶標板的羧化向酶標板中每孔加入5%的酸性高錳酸鉀溶液150μ L, 60°C放置Ih ； b.洗板每孔加入6mol/L HCl 200 μ L,室溫搖動5min，倒出孔內(nèi)液體，拍干，重復洗3次，以除去二氧化錳顆粒；再用蒸餾水洗3次； c.包被用蒸餾水稀釋半抗原DBAP至一定濃度，每孔70μ L加到羧化后的酶標板中，另設一不包被孔做空白對照；每孔加入70yL碳二亞胺(EDC)，37°C搖動過夜，用蒸餾水洗3次，拍干備用。本專利技術利用DBP單克隆抗體，分別通過人工抗原(或半抗原)包被競爭抑制ELISA法測定DBP的含量。本專利技術兩種方法都是利用DBP人工抗原(DBAP-BSA)免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，生物組織樣品(或非生物樣品)中DBP和包被抗原與DBP單克隆抗體競爭結(jié)合，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應和抑制率計算而得到DBP的含量。本專利技術檢測結(jié)果已得到氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術方法的支持，并得到水樣中添加DBP回收計算的支持。本專利技術可以一次處理大量樣品，靈敏度高，方便快捷，穩(wěn)定性好，成本低廉，且由于本專利技術的單克隆抗體對DBP特異性強，因此檢測結(jié)果不受其它酞酸酯的影響；由于DBP在生產(chǎn)和生活中的廣泛使用，又易于釋放到環(huán)境中，DBP可以在某些生物體內(nèi)積累和在環(huán)境中大量存在，因此，本專利技術可以廣泛適用于檢測生物樣品和非生物樣品中鄰苯二甲酸二丁酯的含量，評價環(huán)境中鄰本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法，其特征在于，利用DBP人工抗原DBAP?BSA免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，樣品中DBP和包被抗原DBAP?BSA競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應和抑制率計算，而得到DBP的含量。

【技術特征摘要】
1.一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法，其特征在于，利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP單克隆抗體，樣品中DBP和包被抗原 DBAP-BSA競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，再通過酶聯(lián)二抗的顯色反應和抑制率計算，而得到DBP的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ELISA方法，其特征在于，包括如下步驟1)DBP單克隆抗體的制備；2)抗體效價的測定將人工抗原DBAP-BSA于酶標板中包被、封閉，與不同稀釋度的DBP單克隆抗體結(jié)合，后續(xù)加酶標二抗，顯色，終止，用酶標儀測定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O處抗體稀釋度為單克隆抗體的工作濃度；3)標準抑制曲線的建立將人工抗原DBAP-BSA于酶標板中包被，封閉，不同濃度DBP標準溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標二抗，顯色，終止，用酶標儀測定492nm處的吸光度，以抑制率為縱坐標，DBP濃度為橫坐標，建立抑制率標準曲線；4)測定樣品抑制率，通過抑制標準曲線確定樣品中DBP含量將人工抗原DBAP-BSA于酶標板中包被，封閉，樣品溶液與包被抗原競爭結(jié)合DBP單克隆抗體，后續(xù)加酶標二抗，顯色，終止，用酶標儀測定492nm處的吸光度，計算出抑制率，通過抑制率標準曲線確定樣品中DBP含量。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ELISA方法，其特征在于，所述DBP單克隆抗體制備過程如下人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠，取免疫小鼠脾細胞與瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞并克隆化；小鼠腹水法大量制備單克隆抗體；再通過硫酸銨沉淀法純化DBP單克隆抗體。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的ELISA方法，其特征在于，將人工抗原DBAP-BSA于酶標板中包被的過程為用包被緩沖液將人工抗原DBAP-BSA稀釋到O. 25 μ g/ml或O. 5 μ g/ml, 100 μ L/孔加入酶標板中，同時設置加有100 μ L包被...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：陳明清，楊旭，曾強，魏晨曦，袁均林，丁書茂，
申請(專利權(quán))人：華中師范大學，
類型：發(fā)明
國別省市：