本發明專利技術公開了一種流式細胞術診斷和監測視網膜母細胞瘤腦脊液轉移的熒光探針，包括三種熒光標記抗體，所述三種熒光標記抗體為GD2-FITC抗體、CD56-PE抗體和CD45-PerCP抗體。本發明專利技術的熒光探針能夠與腦脊液中的視網膜母細胞特異性結合，能夠準確快速通過流式細胞術檢測腫瘤細胞是否轉移，具有較好的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種醫療檢測試劑，尤其涉及一種流式細胞術診斷和監測視網膜母細胞瘤腦膜轉移的熒光探針。
技術介紹
視網膜母細胞瘤是嬰幼兒最常見的眼內惡性腫瘤，對視力和生命有嚴重的威脅和危害。它發生于視網膜核層，多發生于5歲以下，可單眼、雙眼先后或同時罹患，90%的患者可以通過手術治療得到康復。但本病易發生顱內腦脊液轉移，常危及患兒生命，需及時采取化療、放療甚至自體干細胞移植等治療措施。因此對腦脊液轉移的早期發現、早期診斷及早期治療是提聞治愈率、降低死亡率的關鍵。目前國內外主要通過MRI和CT及腦脊液細胞形態學檢查來診斷視網膜母細胞瘤腦脊液轉移，但MRI和CT對于早期轉移的患者的診斷不敏感，容易產生假陰性結果，腦脊液細胞形態學檢查由于腦脊液腫瘤細胞因變性或凋亡與淋巴細胞及炎癥細胞難以區別，以及在轉移早期腫瘤細胞數少不易發現等原因，其診斷的準確性及敏感性均較差，對治療療效的監測亦有不足(N. R. Cohen. Cytopathology2009 (20) 256-260)。正是由于目前的對診斷視網膜母細胞瘤腦脊液轉移的各種檢查方法還無法滿足臨床醫生的要求，尋求一種快速簡便且準確性和敏感性高的方法來診斷視網膜母細胞瘤腦脊液轉移及監測療效的方法極為重要。流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是近年來發展起來的高科學技術,它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于一體，同時具有分析和分選細胞功能。流式細胞術不僅可測量細胞大小、內部顆粒的性狀，還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等，可對群體細胞在單細胞水平上進行多參數分析，即在同一細胞上進行2-3種或多種抗原的共同表達的分析，在短時間內檢測分析大量細胞，并收集、儲存和處理數據，進行多參數定量分析，具有敏感性和準確性高的特點。目前臨床上多運用于白血病和淋巴瘤的骨髓標本的診斷，而對視網膜母細胞瘤的診斷罕見報道。由于視網膜母細胞瘤細胞目前沒有單一的特異性的抗原標志物，流式細胞術對視網膜母細胞瘤的診斷關鍵在于多種抗體的組合。
技術實現思路
本專利技術提供了一種流式細胞術診斷和監測視網膜母細胞瘤腦膜轉移的熒光探針，利用該熒光探針可以快速得到診斷結果。一種流式細胞術診斷和監測視網膜母細胞瘤腦脊液轉移的熒光探針，包括三種熒光標記抗體，所述三種熒光標記抗體為⑶2-FITC抗體、⑶56-PE抗體和⑶45-PerCP抗體。視網膜母細胞來源于多能神經外胚層的細胞，而CD56是一類免疫球蛋白樣區域的膜糖蛋白神經細胞粘附分子，在神經外胚層來源的細胞表面表達，NK細胞主要也表達這種140kDa的⑶56異構體，而⑶45是血細胞系列限制性的膜蛋白分子，表達在除了紅細胞外的包括造血干細胞到成熟血細胞(包括NK細胞)膜表面上，因此⑶56+/⑶45-表型可以避免誤診為NK細胞腫瘤，并可以作為判斷神經內分泌腫瘤存在的指證。Chantada等用免疫組化檢測骨髓中細胞神經節苷脂⑶2表達評價進展性的視網膜母細胞瘤[G. L. Chantada. J Pediatr Hematol Oncol 2006(28)369-373]。Laurent 等報道PCR檢測腦脊液細胞⑶2mRNA表達可診斷視網膜母細胞瘤的腦脊液轉移[V. E. Laurent.Molecu Lar MedicineR印orts2010 (3) 253-259]。本專利技術聯合 GD2、CD56 和 CD45 三種熒光標記抗體作為探針檢測腦脊液中的視網膜母細胞瘤細胞，運用多色流式細胞術檢測細胞CD45-/CD56+/GD2+的免疫表型來診斷視網膜母細胞瘤細胞腦脊液轉移。三種熒光標記抗體均為單克隆抗體。本專利技術還提供了一種流式細胞技術診斷和監測視網膜母細胞瘤腦脊液轉移的試劑盒，包括探針溶液，以磷酸緩沖液為溶劑，包含G D2-FITC抗體、⑶56-PE抗體和CD45-PerCP 抗體；溶血劑；磷酸緩沖液；陽性標準品。三種熒光標記抗體的濃度比為1:1 :1。所述探針溶液包含防腐劑，所述防腐劑為疊氮鈉。與現有技術相比，本專利技術的有益效果為本專利技術的熒光探針能夠與腦脊液中的視網膜母細胞特異性結合，能夠準確快速通過流式細胞術檢測腫瘤細胞是否轉移，具有較好的應用前景。附圖說明圖1為本專利技術對視網膜母細胞瘤患者腦脊液標本的檢測結果圖；圖2為本專利技術對視網膜母細胞瘤患者治療后腦脊液標本的檢測結果圖；圖3為本專利技術對病毒性腦膜炎患者腦脊液標本的檢測結果圖；圖4為本專利技術對化膿性腦膜炎患者腦脊液標本的檢測結果圖；圖5為本專利技術對急性白血病患者腦脊液標本的檢測結果圖；各圖中，A :細胞前散射和側散射雙參數散點圖設門(Rl) ；B :顯示流式細胞檢測這群細胞呈CD56+/CD45-表型(R2) ；C :顯示這群細胞呈CD45XD56+/⑶2+表型(R3)。具體實施例方式實施例1研究對象15例病毒性腦膜炎、19例化膿性腦膜炎、52例急性白血病及21例視網膜母細胞瘤患者的腦脊液標本，腦脊液標本均來自浙江大學醫學院附屬兒童醫院門診及住院患者。操作步驟ImL腦脊液500G離心沉淀5分鐘，棄上清，沉淀物加PBS200 U L，混勻，分別加入單克隆熒光標記抗體(⑶2-FITC，CD56-PE，CD45_PerCP) 20 y L，4°C避光反應30分鐘，加入溶血劑lmL，靜置5分鐘，加PBS5mL，500G離心沉淀5分鐘，棄上清，沉淀物加PBS300 u L，混勻，上流式細胞儀檢測。流式圖像分析策略1、FSC和SSC設Rl門；2、CD56+和CD45-細胞設R2門；3、⑶2+和CD56+細胞設R3門分析；4、計算R3門內的陽性細胞百分率。(R2來源于Rl ；R3來源于R2)。5、以腦脊液出現⑶2+⑶56+⑶45-免疫表型細胞為腦膜轉移陽性，同時設立陰性對照。統計方法利用軟件SPSS11. 5 (SPSS Inc.，Chicago, IL, USA)，分析評價診斷方法的敏感性和特異性。各類型標本的檢測結果如圖1、2、3、4、5所示。結果表明病毒性腦膜炎、化膿性腦膜炎及急性白血病患者腦脊液均未檢測到⑶45-/⑶56+/⑶2+免疫表型細胞；3例視網膜母細胞瘤患者手術后6-13個月腦脊液出現CD45-/CD56+/GD2+免疫表型細胞，診斷為視網膜母細胞瘤腦脊液轉移，與臨床最終綜合診斷為視網膜母細胞瘤腦脊液轉移結果一致，診斷的敏感性和特異性均為100%。實施例2試劑盒組成I)探針溶液(2mLX I瓶):⑶2-FITC 2mL PBS (含0. 1%疊氮鈉)含異硫氰酸熒光素標記的IOOil g抗體蛋白(50 u g/mL) ；CD56-PE :2mLPBS (含0. 1%疊氮鈉)含藻紅蛋白標記的IOOii g抗體蛋白(50 u g/mL) ；CD45-PerCP 2mL PBS (含0. 1%疊氮鈉)含草履蟲葉綠素蛋白標記的100 u g抗體蛋白(50 u g/mL);組合物抗體濃度比例⑶2-FITC :⑶56-PE CD45-PerCP 為1:1 :1。2) IOX溶血劑(IOOmLXl瓶):8. 3%氯化銨，含15%多聚甲醛;3) IOX 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH = 7. 4，1M，含 1%疊氮鈉)(IOOmLX I 瓶)；4)陽性標準品(2mLX 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種流式細胞術診斷和監測視網膜母細胞瘤腦脊液轉移的熒光探針，包括三種熒光標記抗體，其特征在于，所述三種熒光標記抗體為GD2?FITC抗體、CD56?PE抗體和CD45?PerCP抗體。
【技術特征摘要】
1.一種流式細胞術診斷和監測視網膜母細胞瘤腦脊液轉移的熒光探針，包括三種熒光標記抗體，其特征在于，所述三種熒光標記抗體為GD2-FITC抗體、CD56-PE抗體和 CD45-PerCP 抗體。2.如權利要求1所述的熒光探針，其特征在于，三種熒光標記抗體均為單克隆抗體。3.一種流式細胞技術診斷和監測視網膜母細胞瘤腦脊液轉移的試劑盒，包括...
【專利技術屬性】
技術研發人員：沈紅強，舒強，趙正言，湯永民，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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